miR-365通过调控ATG3对HCC细胞自噬的作用机制

王丽红 吴慧丽 张利 李宾 刘迎

郑州大学附属郑州中心医院1消化内科，2门诊综合诊疗中心（郑州450000）

肝细胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是临床上最为常见的恶性肿瘤之一，具有较高发病率和致死率，严重威胁人类生命健康。临床上治疗肝癌常见的方式有手术切除、放射治疗、免疫治疗等，但HCC患者预后仍不理想［1］。自噬是细胞自我消化过程，可将细胞质内衰老或受损细胞器及一些大分子物质包裹在囊泡，形成自噬泡，与溶酶体融合，降解为小分子物质，对维持细胞内环境稳态至关重要［2］。自噬过程在细胞内受严格调控，不仅是细胞正常生理状态下的生存机制，同时与肿瘤发生发展密切相关［3］。在HCC发展过程中，自噬具有双重作用，HCC发展初期，自噬可抑制肿瘤细胞生长，在发展阶段，自噬可为肿瘤细胞提供营养促进肿瘤细胞增殖［4］。微小RNA（microRNA，miRNA）参与基因表达与调控，与自噬过程密切相关，其通过对自噬水平的调控，影响肿瘤结局。miR-365是miRNA家族一员，在肝癌细胞中表达下调，但关于miR-365与HCC细胞自噬关系报道较少［5］。本研究通过探讨miR-365在HCC中对自噬的作用及可能机制，旨在为治疗HCC提供新的靶点和方向。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床资料选取本院收治确诊为HCC患者13例，其中男性8例，女性5例，年龄26 ～61岁，平均年龄（41.37 ± 5.16）岁，收集患者术后HCC组织与癌旁组织，保存于液氮中。纳入标准：年龄18岁；符合临床HCC诊断标准，患者均接受根治术，术后经病理验证为HCC。排除标准：无影像学资料及合并其他恶性肿瘤患者。

1.1.2 细胞系和试剂人肝癌SMMC-7721细胞、肝癌HepG2细胞，人正常肝细胞L02购于中国科学院上海细胞库。DMEM培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（美国Gibco公司），含有miR-365激动剂（miR-365-mimics）、无义随机序列（miR-365-NC）的pcDNA3.1重组质粒（上海吉玛制药技术有限公司），兔抗人自噬相关基因3（autophagy related gene 3，ATG3）多抗、自噬微管相关蛋白轻链3-II（microtubule-associated protein1 light chain3-II，LC3-II）多抗、p62单抗、Beclin1单抗（美国Abcam公司），HRP标记的山羊抗兔二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司），双荧光素酶报告基因检测试剂盒（美国Promega公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、转染及分组取人肝癌SMMC-7721细胞、肝癌HepG2细胞，人正常肝细胞L02，放入含有10%FBS+100 U/mL青霉素+100 μg/mL链霉素的DMEM培养基中，于体积分数5%CO2、37 ℃条件下恒温培养。2 ～3 d传代一次，取对数生长期SMMC-7721细胞，按1×105个/mL接种于6孔板，随机分为对照组、NC组（转染miR-365无序对照序列miR-365-NC）过表达组（转染miR-365-mimics）。继续培养48 h，荧光显微镜下观察转染效率均＞85%，可用于后续实验。

1.2.2 RT-qPCR 检测组织与细胞中miR-365、ATG3 mRNA 表达水平取患者HCC组织与癌旁组织，转染与未转染SMMC-7721细胞，HepG2肝癌细胞，人正常肝细胞L02，Trizol法提取总RNA，测定总RNA浓度和纯度，逆转录cDNA，进行RT-qPCR。反应体系：上下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，加ddH2O至总体积25 μL。反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性10 s，55 ℃退火10 s，70 ℃延伸30 s，45个循环。miR-365以U6为内参，ATG3以β-actin为内参，采用2-CT法计算目的基因的相对表达水平。引物由上海生工合成，引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.3 MTT 法检测细胞增殖情况各组细胞，按2 × 105个/mL接种于96孔板，培养48 h后，20 μL/孔加入MTT溶液（5 mg/mL），继续孵育4 h，150 μL/孔加入DMSO，震荡10 min，用酶标仪在450 nm处检测吸光度（A）值。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡情况各组细胞按1 × 106个/mL接种于6孔板，培养48 h，胰酶消化，1 500 r/min离心5 min，弃上清，加入200 μL Binding Buffer重悬细胞，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染色液，混匀，室温避光孵育20 min，上流式细胞仪检测凋亡情况。

1.2.5 电镜观察细胞自噬情况取各组细胞按1×106个/mL接种于6孔板，培养48 h后胰酶消化收集细胞，1 200 r/min离心10 min，弃上清，加入4%戊二醛，4 ℃固定24 h，1%四氧化锇4 ℃固定1 h，梯度乙醇和丙醇脱水，环氧树脂包埋，切片（片厚约100 μm），醋酸铀和枸橼酸铅定位染色后封片，电镜观察。

1.2.6 Western blot 法检测细胞中ATG3、LC3-II、Beclin1、p62蛋白相对表达水平取各组细胞，加入细胞裂解液，提取总蛋白，BCA法定量，蛋白变性，上样进行SDS-PAGE电泳，转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，TBST洗膜，加入1∶2 000稀释的ATG3、LC3-II、Beclin1、p62一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，加入二抗37 ℃孵育2 h，加入ECL曝光显影，以β-actin为内参，采用Image J软件进行灰度分析，计算目的蛋白相对表达水平。

1.2.7 双荧光素酶报告基因系统检测miR-365 与ATG3靶向性根据生物信息学软件分析预测miR-365与ATG3之间的结合位点，将ATG3-3′UTR插入荧光素酶报告载体pMIR-REPORT，分别构建野生型重组质粒pMIR-ATG3-MT和突变型重组质粒pMIR-ATG3-MUT，利用LipofectamineTM 2000转染试剂将miR-365-mimcs-NC/miR-365-mimcs与野生组和突变组质粒共转染SMMC-7721细胞，48 h后，检测荧光素酶活性。

1.3 统计学方法采用SPSS 25.0统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差表示，多样本计量资料比较采用单因素方差分析，两两样本比较采用LSD-t检验。P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCC 患者组织与不同肝细胞系中miR-365 和ATG3 mRNA 表达情况HCC患者癌组织中miR-365、ATG3表达明显低于癌旁组织（P ＜0.05），见图1。肝癌SMMC-7721细胞、HepG2细胞中miR-365和ATG3表达均低于正常L02细胞（P ＜0.05），且SMMC-7721细胞较HepG2细胞更低（P ＜0.05），见图2。后续实验选择SMMC-7721细胞。

2.2 SMMC-7721 细胞转染后miR-365 和ATG3 mRNA 表达情况过表达组miR-365、ATG3相对表达量明显高于对照组、NC组（P ＜0.05），见图3。

图1 HCC 患者不同组织miR-365、ATG3 表达情况Fig.1 The expression of miR-365 and ATG3 in different tissues of HCC patients

图2 不同细胞系中miR-365、ATG3 表达情况Fig.2 The expression of miR-365 and ATG3 in different cell line

图3 各组细胞miR-365、ATG3 相对表达量比较Fig.3 Comparison of relative expression levels of miR-365 and ATG3 in each group of cells

2.3 细胞增殖情况过表达组细胞A值明显低于对照组、NC组（P ＜0.05）。见图4。

2.4 细胞凋亡情况过表达组细胞凋亡率明显高于对照组、NC组（P ＜0.05），见图5。

图4 各组细胞A 值比较Fig.4 Comparison of cell A values in each group

图5 各组细胞凋亡率比较Fig.5 Comparison of cell apoptosis rate in each group

2.5 透射电镜观察结果透射电镜观察显示，对照组、NC组内质网、溶酶体等细胞器结构正常；过表达组出现大小不一、包裹细胞器的圆形自噬泡（箭头指示），见图6。

2.6 细胞中ATG3、LC3-II、p62、Beclin1 蛋白相对表达量过表达组细胞中ATG3、LC3-II、Beclin1蛋白相对表达量明显高于对照组、NC组，p62蛋白相对表达量明显低于对照组、NC组（P ＜0.05），见图7。

图6 透射电镜观察自噬（×25 000）Fig.6 Observation of autophagy under transmission electron microscope（×25 000）

图7 细胞中ATG3、LC3-II、p62、Beclin1 蛋白表达Fig.7 Protein expression of ATG3，LC3-II，p62，Beclin1 in cells

2.7 双荧光素酶报告基因系统检测miR-365 与ATG3 靶向性生物学信息软件显示，ATG3存在miR-365结合位点，见图8A；进一步荧光素酶实验显示，转染miR-365 mimics可明显抑制野生型ATG3相对荧光素酶活性（P ＜0.05），而对突变型ATG3无明显影响（P ＞0.05），见图8B。

图8 miR-365 靶向调节ATG3 表达（A：miR-365 与ATG3 存在连续结合位点；B：miR-365 靶向抑制ATG3）Fig.8 miR-365 targeted regulation of ATG3 expression（A：miR-365 and ATG3 have continuous binding sites；B：miR-365 targeted inhibition of ATG3）

3 讨论

自噬与肿瘤发生发展过程关系密切，通过探讨肿瘤细胞自噬的分子机制，对治疗肿瘤具有重要意义［6］。自噬通过降解细胞组分，为细胞提供营养物质，维持细胞正常代谢，并可防止化疗药物诱导的细胞凋亡，保护细胞免受药物作用，促进细胞耐药；另一方面，自噬也可导致细胞死亡，通过诱导自噬促进细胞凋亡，发挥抑癌作用，在治疗癌症中具有潜在效应［7］。miRNA参与调控基因表达，通过调节自噬过程中关键蛋白的表达，对肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移过程表现出直接或间接调控作用，从而发挥抑癌或促癌作用，为肿瘤的治疗提供新靶点和新思路［8］。

miRNA在肿瘤组织中通过上调或下调下游相关基因，对肿瘤的结局和预后产生不同影响［9］。不同肿瘤组织中miR-365表达存在差异，其在皮肤鳞状细胞癌中表达上调，在肺癌、口腔鳞状细胞癌细胞中低表达［10-12］。HE等［13］报道显示，miR-365在HCC癌组织表达明显低于癌旁组织，miR-365下调可通过多种途径促进HCC进展和转移。本研究通过检测HCC患者癌组织与癌旁组织中miR-365表达，结果显示癌组织中miR-365表达显著低于癌旁组织，与以上结果一致。为进一步证实miR-365在HCC中的表达，本研究对不同HCC细胞系及正常肝细胞系中miR-365表达情况进行检测，结果显示，HCC细胞系中miR-365表达明显低于正常肝细胞，进一步验证miR-365在HCC中低表达。为揭示miR-365在HCC中作用机制，本研究采用miR-365转染SMMC-7721细胞，结果显示，miR-365过表达后，细胞增殖能力降低，凋亡率升高，与JIANG等［14］研究结果一致，提示过表达miR-365可抑制HCC细胞增殖促进其凋亡。

过表达miR-365可诱导HCC细胞凋亡，阻止原发性肿瘤生长，通过诱导自噬促进HCC细胞凋亡是抑癌的重要分子机制之一［15-16］。在肥大型心肌细胞中，miR-365表达显著上调，可负向调控心肌细胞自噬，引起自噬失调［17］。细胞自噬受机体多种基因和蛋白严密调控，参与调控自噬的基因统称为ATG家族，其中ATG3参与调节LC3蛋白脂化系统［18］。LC3分为Ⅰ型和Ⅱ型，发生自噬时，Ⅰ型经泛素样修饰转变成Ⅱ型，LC3-Ⅱ含量与自噬泡数量成正比，是发生自噬的标志性蛋白。Beclin1是自噬启动因子，其活性下降或缺失抑制自噬的启动，促进肿瘤进展。p62蛋白是自噬负性调控因子，参与调节自噬降解途径。本研究转染miR-365后，透射电镜提示细胞发生自噬，进一步经Western blot检测，结果显示过表达miR-365后，ATG3、LC3-II、Beclin1蛋白表达升高，p62蛋白表达下降，提示过表达miR-365抑制SMMC-7721细胞增殖促进细胞凋亡，可能与诱导细胞发生自噬有关。

miR-365下游有众多靶基因，通过调节不同靶基因表达，发挥相应生物学功能［19］。本研究通过miR靶基因预测软件预测miR-365与ATG3存在相互结合位点，经双荧光素酶实验验证miR-365与ATG3之间存在靶向性，与YANG等［20］研究结果一致，由此推测，过表达miR-365可能是通过靶向促进ATG3表达，激活细胞自噬，诱导细胞凋亡，抑制细胞增殖。

综上所示，过表达miR-365可诱导HCC细胞自噬，从而抑制细胞增殖促进其凋亡，其可能是通过靶向上调ATG3表达，调节细胞自噬水平，为临床治疗HCC提供新的治疗靶点。