lncRNA ZNF571-AS1对前列腺癌细胞增殖及侵袭能力的影响

杨凌博 杨金辉 鲁帅奇 李小辉 卢绩

1郑州大学附属洛阳中心医院泌尿外科（河南洛阳471009）；2吉林大学附属第一医院泌尿外科（长春130021）

前列腺癌是男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，前列腺癌的发病率逐年增加，严重威胁男性健康［1］。早期前列腺癌的治疗方式是根治性手术，治疗效果较好［2］。但由于早期前列腺癌多无明显症状，导致多数患者发现时已是中晚期前列腺癌［3］。探究前列腺癌发生、发展的分子机制，可能对前列腺癌的早期诊断和分子靶向治疗具有重要临床意义。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）存在于真核细胞，长度大于200个核苷酸，不能编码蛋白质［4］。在人类几乎所有恶性肿瘤中存在lncRNA的异常表达，其表达水平与肿瘤细胞的各种生物学行为相关［5］。前列腺癌中存在lncRNA的异常表达，通过检测前列腺癌组织或患者血清lncRNA的表达可能有助于前列腺癌的早期诊断［6］。ZNF571-AS1是近年来新发现的lncRNA，可能参与急性髓细胞性白血病的发生、发展［7］。ZNF571-AS1在前列腺癌组织中的表达和分子机制尚不清楚。本研究拟分析ZNF571-AS1在前列腺癌组织和细胞系中的表达，观察ZNF571-AS1对前列腺癌细胞增殖和侵袭的影响，探讨其可能的分子机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 临床标本52例前列腺癌组织及癌旁组织均取自2018年3月至2019年5月郑州大学附属洛阳中心医院泌尿外科住院患者。所有组织标本均经两名以上病理学专家确诊，所有患者术前均未接受过放疗和化疗。患者年龄平均（59.43±14.63）岁。Gleason评分：＜7分27例，7分25例。临床分期：Ⅰ和Ⅱ期33例，Ⅲ和Ⅳ期19例。本研究经本院医学伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.1.2 细胞与试剂正常前列腺上皮细胞（RWPE-1）和前列腺癌细胞系（DU-145、C4-2B、LNCaP、PC-3）购于中国典型培养物保藏中心。qPCR试剂盒购于南京建成生物工程研究所。沉默ZNF571-AS1基因的质粒和阴性对照质粒购于上海吉玛基因股份有限公司。Matrigel基质胶、一抗和二抗购于美国BD公司。培养基和胎牛血清购于美国Hyclone公司。转染试剂LipofectamineTM 3000购于美国Invitrogen公司。Transwell小室购于美国Corning公司。噻唑蓝（methyl thiazol tetrazolium，MTT）试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和转染前列腺癌细胞系用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养，正常前列腺上皮细胞用含10%胎牛血清的KSFM培养基培养。将对数生长期的DU-145细胞采用LipofectamineTM 3000试剂转染沉默ZNF571-AS1基因的质粒和阴性对照质粒，命名为实验组和对照组，转染操作按照说明书进行。

1.2.2 qPCR 检测ZNF571-AS1、miR-301b-3p 和AR mRNA 的表达TRIzol法提取组织及细胞总RNA，进一步逆转录为cDNA。建立qPCR反应体系，以GAPDH作为内参，检测ZNF571-AS1和AR mRNA的表达；以U6作为内参，检测miR-301b-3p的表达。引物序列如下，ZNF571-AS1正向引物：GGTCTCGGTACATGCGTGGA，反向引物：TGGCAGTATAACAGGCTCCC；miR-301b-3p正 向 引 物：GGGCTTTGACAATATCATTG，反向引物：CAGTGCGTGTCGTGGAGT；GAPDH正向引物：CTGGGCTACACTGAGCACC，反向引物：AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG；AR正向引物：CCAGGGACCATGTTTTGCC，反向引物：CGAAGACGACAAGATGGACAA。U6正向引物：CTCGCTTCGGCAGCACA，反向引物：AACGCTTCACGAATTTGCGT。应用2-ΔΔCt方法计算相对表达量。

1.2.3 MTT 法检测DU-145 细胞的增殖能力收集两组细胞，分别以3 × 103个/孔接种于96孔板。检测时每孔加入20 μL MTT试剂，继续培养4 h。加150 μL/孔二甲基亚砜，振荡10 min，酶标仪测定每孔450 nm波长处的光密度（OD）值，分别检测第1、2、3、4、5天细胞的增殖活性。

1.2.4 小室（Transwell）实验检测DU-145 细胞的侵袭能力采用培养基稀释Matrigel基质胶，按50 μL每孔包被小室底膜上室。收集两组细胞，分别以3 × 104个/孔接种于上室，下室加入600 μL含胎牛血清的RPMI-1640培养基。培养箱内培养24 h后，棉签擦去未侵袭的细胞，采用多聚甲醛固定，采用0.1%结晶紫染液染色，PBS溶液冲洗。在100倍显微镜下每孔随机取4个视野，计数并拍照。

1.2.5 生物信息学技术预测ZNF571-AS1 的分子机制采用生物信息学网站starBase v2.0预测ZNF571-AS1可互补结合的miRNA。采用生物信息学网站RNAhybrid预测miR-301b-3p可互补结合的靶基因mRNA。

1.2.6 Western blot法检测AR蛋白和PI3K/Akt信号通路蛋白的表达收集两组细胞并提取细胞蛋白，测定蛋白浓度。采用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳分离蛋白，转膜后应用5%脱脂牛奶封闭。采用一抗孵育，在4 ℃下过夜。洗膜后，采用二抗在室温下孵育。洗膜后，采用ECL法发光、显影。

1.2.7 统计学方法所有数据均采用SPSS 19.0软件统计分析，计量资料以均数±标准差表示，组间均数比较采用方差分析及t检验，以P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 前列腺癌组织和癌旁组织中ZNF571-AS1 的表达前列腺癌组织和癌旁组织中ZNF571-AS1的表达分别为（5.71 ± 0.61）和（0.69 ± 0.18），前列腺癌组织中ZNF571-AS1表达显著高于癌旁组织（P ＜0.01），见图1。

图1 前列腺癌组织和癌旁组织中ZNF571-AS1 的表达Fig.1 ZNF571-AS1 expression in prostate cancer tissues and adjacent tissues

2.2 前列腺癌细胞和正常前列腺上皮细胞中ZNF571-AS1的表达与正常前列腺上皮细胞相比，前列腺癌细胞系中ZNF571-AS1的表达显著较高（P ＜0.05），DU-145细胞中ZNF571-AS1的表达最高（P ＜0.01），因而选择DU-145细胞进行研究。见图2。

图2 前列腺癌细胞和正常前列腺上皮细胞中ZNF571-AS1 的表达Fig.2 ZNF571-AS1 expression in prostate cancer cells and normal prostate epithelial cells

2.3 两组DU-145 细胞中ZNF571-AS1 的表达qPCR结果显示，实验组和对照组DU-145细胞中ZNF571-AS1表达分别为（0.17 ± 0.04）和（1.01 ±0.06），实验组显著低于对照组（P ＜0.01），提示转染成功。

2.4 低表达ZNF571-AS1抑制DU-145细胞的增殖能力MTT法结果显示，从 第2天起，实验组DU-145细胞增殖能力显著低于对照组（P ＜0.05）。见图3。

图3 MTT 检测ZNF571-AS1 对DU-145 细胞增殖能力的影响Fig.3 MTT was used to detect the effect of ZNF571-AS1 on the proliferation ability of DU-145 cells

2.5 低表达ZNF571-AS1 抑制DU-145 细胞的侵袭能力小室（Transwell）实验显示，实验组和对照组DU-145细胞侵袭细胞数分别为（33.37±5.33）个和（87.55±6.72）个，与对照组相比，低表达ZNF571-AS1后显著抑制DU-145细胞的侵袭能力（P ＜0.01），见图4。

2.6 生物信息学技术预测ZNF571-AS1 的分子机制采用生物信息学网站starBase v2.0预测ZNF571-AS1可互补结合miR-301b-3p。采用生物信息学网站RNAhybrid预测miR-301b-3p可互补结合AR mRNA。见图5。

2.7 低表达ZNF571-AS1 的前列腺癌细胞中miR-301b-3p 和AR mRNA 的表达qPCR结果显示，实验组和对照组DU-145细胞miR-301b-3p的表达分别为（5.28±0.49）和（1.08±0.40），低表达ZNF571-AS1可促进miR-301b-3p的表达（P ＜0.01）。实验组和对照组DU-145细胞AR mRNA的表达分别为（0.38 ± 0.05）和（1.01 ± 0.06），提示miR-301b-3p表达增加后，AR mRNA表达降低（P ＜0.01）。

2.8 低表达ZNF571-AS1促进AR蛋白表达Western blot结果显示低表达ZNF571-AS1引起AR蛋白表达升高，AR蛋白表达升高后，造成PI3K/Akt信号通路蛋白如p-PI3K、p-Akt及p-GSK3β蛋白表达降低，PI3K/Akt信号通路转导被抑制。见图6。

图4 小室（Transwell）实验检测ZNF571-AS1 对DU-145 细胞侵袭能力的影响Fig.4 Transwell invasion test was used to detect the effect of ZNF571-AS1 on the invasion ability of DU-145 cells

图5 生物信息学技术预测ZNF571-AS1 的分子机制Fig.5 Bioinformatics technology predicted the molecular mechanism of ZNF571-AS1

图6 Western blot 法检测AR 蛋白及PI3K/Akt 信号通路蛋白表达情况Fig.6 Western blot method was used to detect the expression of AR protein and PI3K/Akt signaling pathway proteins

3 讨论

lncRNA是一类内源性非编码RNA，缺乏开放阅读框［8］。lncRNA可调控基因的转录和翻译，参与包括前列腺癌在内的各种肿瘤的发生、发展［9］。越 来 越 多 的lncRNA如MNX1-AS1［10］、GAS5［11］、PCAT1［12］、CCAT1［13］、LINC01638［14］等被发现在前列腺癌中异常表达，影响前列腺癌细胞的生物学行为。ZNF571-AS1是近年来新发现的长链非编码RNA，有研究［7］表明，ZNF571-AS1可能发挥癌基因作用，促进急性髓细胞性白血病的发生、发展。ZNF571-AS1在前列腺癌中的表达和功能尚不明确。本研究中，ZNF571-AS1在前列腺癌组织和细胞系中均呈高表达，表明其可能在前列腺癌细胞中发挥癌基因作用。MTT实验和小室实验显示，下调ZNF571-AS1可抑制前列腺癌细胞的增殖和侵袭能力，进一步证明ZNF571-AS1在前列腺癌细胞中发挥肿瘤促进作用。

lncRNA携带有特定miRNA的“种子序列”，可吸附结合miRNA，阻止miRNA与其靶基因mRNA结合，从而抑制miRNA对靶基因表达的干扰作用［15］。本研究采用starBase v2.0网站预测，ZNF571-AS1可互补结合miR-301b-3p。miR-301b-3p可能在肝癌组织和细胞系中表达降低，上调miR-301b-3p具有抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用［16］。本研究发现，下调ZNF571-AS1后，前列腺癌细胞中miR-301b-3p表达增加，提示ZNF571-AS1可能通过吸附结合miR-301b-3p。miRNA主要通过结合靶基因mRNA区域，抑制其翻译或者直接导致其降解，从而抑制靶基因的表达［17］。本研究采用RNAhybrid网站预测，miR-301b-3p可互补结合雄激素受体（Androgen receptor，AR）mRNA。AR属于类固醇激素受体家族，定位于Xq11-12［18-19］。AR在前列腺癌组织和细胞系中表达明显增加，与前列腺癌的发生、发展显著相关［20］。下调AR表达可明显抑制前列腺癌细胞的生长和转移［21］。本研究发现，miR-301b-3p表达增加后，前列腺癌细胞中AR基因表达下调，提示miR-301b-3p可能具有抑制AR基因表达的作用。有研究［22］表明，AR通过促进PI3K/Akt信号通路转导，促进细胞的生长和转移。本研究证明，AR基因表达降低后，PI3K/Akt信号转导通路蛋白如p-PI3K、p-Akt及p-GSK3β表达明显降低，表明PI3K/Akt信号通路转导被干扰。本研究下一步将通过双荧光素酶报告基因实验验证ZNF571-AS1与miR-301b-3p及miR-301b-3p与AR mRNA之间的结合。

综上所述，lncRNA ZNF571-AS1在前列腺癌组织和细胞系中高表达，下调ZNF571-AS1可能通过调控miR-301b-3p/AR信号通路抑制前列腺癌细胞的增殖和侵袭能力。因此，ZNF571-AS1在前列腺癌分子靶向治疗中具有一定的研究价值。