硫辛酸灌胃对大鼠肾缺血再灌注后肝损伤的防治作用及机制探讨

王佳，王丽萍，张伟

(华北理工大学，河北唐山 063000)

硫辛酸灌胃对大鼠肾缺血再灌注后肝损伤的防治作用及机制探讨

王佳，王丽萍，张伟

(华北理工大学，河北唐山 063000)

目的观察硫辛酸(LA)灌胃对大鼠肾缺血再灌注(RIR)后肝损伤的防治作用，并探讨其机制。方法30只SD大鼠随机分为3组各10只，对照组及模型组常规饲养，实验组灌胃给予250 mg/(kg·24 h)的LA，连续饲养4周。实验组及模型组制备RIR模型，对照组除不夹闭双侧肾动、静脉外，其余操作均与实验组及模型组相同。检测各组血浆肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、谷草转氨酶(ALT)、谷丙转氨酶(AST)、一氧化氮(NO)和肝组织Ca2+、黄嘌呤氧化酶(XOD)、活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、髓过氧化物酶(MPO)，比较肝细胞线粒体Ca2+及Na+-K+-依赖ATP提供能量运转的离子泵(ATPase)、Ca2+-Mg2+-ATPase、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性，观察肝组织ICAM-1、Caspase-3、Hsp70蛋白表达情况。结果与对照组比较，模型组血浆Scr、BUN、ALT、AST、NO升高，肝组织Ca2+、XOD、ROS、MDA、MPO升高，肝线粒体Ca2+升高，Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase、GSH-Px活性降低；ICAM-1蛋白表达增强，肝组织Caspase-3、Hsp70阳性率升高。与模型组比较，实验组血浆Scr、BUN、ALT、AST降低，肝组织Ca2+、XOD、ROS、MDA降低，肝线粒体Ca2+降低，Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase、GSH-Px活性升高，血浆NO升高，肝组织MPO降低，ICAM-1表达减弱，Caspase-3阳性细胞数减少，Hsp70阳性细胞数增多。结论LA对RIR后肝损伤有防治作用，其机制可能通过抗氧化、保护线粒体、抑制炎症因子、抗凋亡等途径来实现。

硫辛酸；缺血再灌注损伤；肝损伤；氧化应激；炎性反应；细胞凋亡

肾缺血再灌注损伤(RIRI)是一个非常复杂的病理过程，其主要通过线粒体损伤、炎症、凋亡、氧化应激等途径造成肾脏损伤[1～4]。大多数情况下，肾缺血再灌注(RIR)不仅损伤原位器官，还可引起远隔器官损伤，而肝脏是人体内最大的实质性器官，其血流量大，易受循环中有害物质影响而出现病理改变和功能损伤。硫辛酸(LA)作为一种类维生素物质，能抵抗多种氧自由基，又能与金属离子(如铁、铜、镉、铅、汞等金属离子)螯合[5]，还能促进线粒体葡萄糖代谢循环、增加能量产生、影响新陈代谢、缓解炎症、增强免疫系统及启动细胞修复机制等[6,7]。本研究观察了LA对大鼠RIR后肝损伤的防治作用，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康雌性SPF级SD大鼠30只[由华北理工大学实验动物中心提供，实验动物编号SCXK(京)2012-0001]，56～62日龄。所有大鼠随机分为实验组、模型组、对照组各10只。

1.2 LA给予方法及RIR模型制备 制备模型前对照组及模型组常规饲养，实验组灌胃给予250 mg/(kg·24 h)的LA，连续饲养4周。后实验组及模型组大鼠以3%戊巴比妥钠溶液(100 mg/kg)腹腔麻醉，开腹，暴露并夹闭双侧肾动、静脉45 min后恢复血流，复制RIR模型；操作中观察肾脏由红变白再变红，即认为肾脏经历缺血再灌注损伤，即造模成功；模型复制后逐层缝合大鼠腹膜、腹壁肌肉和皮肤。对照组除不夹闭双侧肾动、静脉外，其余手术操作均与实验组及模型组相同。

1.3 血浆肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、谷草转氨酶(ALT)、谷丙转氨酶(AST)、一氧化氮(NO)检测 再灌注6 h，大鼠经麻醉后开腹，取腹主动脉血。分别采用苦味酸不除蛋白法和OPA法检测Scr、BUN，采用赖氏法检测ALT、AST；采用硝酸还原酶法检测NO，通过显色深浅检测其浓度高低。

1.4 肝组织Ca2+、黄嘌呤氧化酶(XOD)、活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、髓过氧化物酶(MPO)检测 再灌注6 h，大鼠经麻醉后开腹，取肝组织，液氮速冻后-70 ℃保存。取0.5 g肝组织，用冷生理盐水制成10%匀浆，采用火焰法检测肝组织中Ca2+，比色法检测XOD、ROS、MDA、MPO。

1.5 线粒体Ca2+及Na+-K+-依赖ATP提供能量运转的离子泵(ATPase)、Ca2+-Mg2+-ATPase、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性检测 取部分肝组织，制成10%组织匀浆，后离心取沉淀，采用比色法检测线粒体中Ca2+和Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase、GSH-Px酶活性。

1.6 肝组织ICAM-1蛋白检测 采用Western blotting法。取100 mg液氮冻存的肝组织，加入组织蛋白裂解液0.5 mL，充分研磨,取出匀浆液，4 ℃离心(15 000 r/min)20 min。取100 μg蛋白样品，于100 ℃煮沸3 min后上样，进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后，在冰浴中以350 mA电转移2 h，将蛋白转移至PVDF膜上，后经以下程序：①BSA封闭；②加ICAM-1Ⅰ抗(1∶1 000)置4 ℃冰箱振荡孵育过夜，TBST洗膜；③加入HRP标记的Ⅱ抗(1∶3 000)室温反应1 h，TBST洗涤；④ECL化学发光试剂于暗室中显影，X光胶片曝光，拍照。以Quantity One对条带进行定量分析，结果以目的条带和β-actin条带积分灰度值比值得出。

1.7 肝组织Caspase-3蛋白检测 采用免疫组化染色法。制备4 μm肝组织石蜡切片，以Caspase-3抗体为一抗(Caspase-3抗体为北京中山生物技术公司产品)，进行过氧化物酶标记的链霉卵白素(SP)染色(染色按SP试剂盒说明书操作)和二氨基联苯胺(DAB)显色，复染，透明，封片镜检。高倍镜下，以胞质染成棕色定义为阳性。根据阳性细胞分布情况，在400倍高倍镜视野下，1 000个肝细胞中(每张切片随机选择10个视野，每个视野计数100个细胞)，计算Caspase-3表达阳性率，阳性细胞表达指数(PEI)=(阳性细胞数/计数细胞总数)×100%。

1.8 肝组织Hsp70蛋白检测 采用免疫组化染色法。制备4 μm肝组织石蜡切片，染色操作按试剂盒说明书进行。高倍镜下，以胞质染成棕色的细胞为Hsp70蛋白表达阳性细胞。根据阳性细胞分布情况，在400倍高倍镜视野下，1 000个肝细胞中(每张切片随机选择10个视野，每个视野计数100个细胞)计算Hsp70蛋白表达阳性率，PEI=(阳性细胞数/计数细胞总数)×100%。

2 结果

2.1 各组血浆Scr、BUN、ALT、AST、NO含量比较 结果见表1。

表1 各组血浆Scr、BUN、ALT、AST、NO含量比较

注：与对照组比较，△P<0.05；与模型组比较，*P<0.05。

2.2 各组肝组织Ca2+含量、XOD、ROS、MDA、MPO含量比较 结果见表2。

表2 各组肝组织Ca2+、XOD、ROS、MDA、MPO含量比较

注：与对照组比较，△P<0.05；与模型组比较，*P<0.05。

2.3 各组肝线粒体Ca2+含量及Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase、GSH-Px活性比较 结果见表3。

表3 各组肝线粒体Ca2+含量及Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase、GSH-Px活性比较

注：与对照组比较，△P<0.05；与模型组比较，*P<0.05。

2.4 各组肝组织ICAM-1、Caspase-3、Hsp70蛋白表达比较 结果见表4。

3 讨论

表4 各组肝组织ICAM-1、Caspase-3、Hsp70蛋白表达比较

注：与对照组比较，△P<0.05；与模型组比较，*P<0.05。

各种手术操作如夹闭主动脉、肾血管引起短暂的肾血流停顿，或出血性休克引起的血流骤减，都会造成肾脏代谢产物的聚集，甚至发生严重的肾组织损伤和功能障碍[1～3]，增加了患者的住院时间和病死率[2]。RIRI是一个非常复杂的病理过程，主要通过线粒体损伤、炎症、凋亡、氧化应激等途径造成肾脏损伤[4～7]。在大多数情况下，RIR不仅损伤原位器官，还可引起远隔器官损伤，而肝脏是人体内最大的实质性器官，血流量大，易受循环中的有害物质影响而致肝脏出现病理改变和功能损伤。

LA是硫醇类化合物，具有显著的亲电性及与自由基反应能力，可以提高细胞溶质中谷胱甘肽水平清除ROS，也可直接清除氧自由基[8]。LA不仅具有较强抵抗长时间氧化损伤的作用，还可以有效修复维生素C和维生素E不能修复的、较严重的细胞氧化损伤。LA兼具脂溶性和水溶性，可以深入到细胞中的各个部位，是人体内不可缺少的抗氧化剂，口服和静脉途径给药都可以良好吸收，可以透过血脑屏障。LA能与金属离子(如铁、铜、镉、铅、汞等金属离子)螯合[9]，表现出很强的抗氧化性，乃至起到重金属离子中毒的解毒作用。还能促进线粒体的葡萄糖代谢循环、增加能量产生、影响新陈代谢、缓解炎症、增强免疫系统及启动细胞修复机制等[10,11]。有研究[12]表明，LA可减少机体氧化对内皮细胞和上皮细胞的损伤，有效维持内皮细胞和上皮细胞完整性，形成屏障，减少血管内液体及溶质从血管内渗到血管外，有利于氧合，减轻炎症反应。多项研究[13～16]表明，LA预处理可以减低心肌、睾丸、肾脏、肝脏等器官缺血再灌注损伤。LA有抗氧化应激的作用，近几年其主要应用于糖尿病周围神经病变治疗中，获得了良好的疗效，但其对RIR造成肝损伤的保护作用鲜有报道。

血浆Scr、BUN是反映肾小球滤过率的敏感标志物。本研究显示，大鼠RIR时血浆Scr、BUN均增加，表明RIRI模型制备成功。血浆ALT、AST变化可以反映肝损伤程度[17]。本研究发现，与对照组比较，模型组血浆ALT、AST增高,提示RIR后肝细胞受损；而实验组血浆ALT、AST明显低于模型组，提示肝细胞损伤的程度减轻，说明LA可以减轻RIR后对肝的损伤。

RIR后肾脏钙超载联合其他原因可导致肝细胞胞质Ca2+升高，线粒体通过从胞质摄取过量的Ca2+来维持胞质内钙稳态，从而导致线粒体基质Ca2+升高[18]，并且RIR后肝脏中ATPase如Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase的活性受到明显抑制，导致细胞内Ca2+和Na+超载[19～21]，细胞内钙离子超载促进黄嘌呤脱氢酶变成XOD，使得次黄嘌呤变成黄嘌呤，并且产生大量的ROS。GSH-Px作为一种重要的过氧化物分解酶，是体内重要的氧自由基清除剂[22]。MDA是脂质过氧化反应的终产物,其反映了机体脂质过氧化的强度和速度。本研究显示，与对照组比较，模型组肝组织线粒体中Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性降低，肝组织内和线粒体中Ca2+增高，肝组织中ROS、XOD、MDA增多，而GSH-Px酶活性降低。说明在RIR发生后，各种原因使大鼠肝组织Ca2+升高，导致肝细胞线粒体钙超载和线粒体损伤；线粒体钙超载合并其他因素导致大鼠肝内产生了大量ROS，而GSH-Px活性下降，ROS清除不足，ROS与脂类物质发生过氧化反应，引起MDA等脂类过氧化产物的大量堆积。以上结果提示当RIR发生后，遭受氧化应激损伤的不仅有肾组织，还有肝细胞及其线粒体，这可能是导致肝功能严重受损的重要机制之一。本研究还显示，与模型组比较，实验组线粒体中Ca2+和肝组织内Ca2+、ROS、XOD、MDA降低，GSH-Px酶活性升高，肝组织线粒体中Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性升高。提示LA不仅可增强肝组织线粒体组分中ATPase活性和线粒体清除活性氧自由基的能力，还可以保护和促进相关的抗氧化酶GSH-Px活性，减少肝脏脂质过氧化物的产生，从而保护线粒体和肝细胞，进而减轻肾脏缺血再灌注对肝的损害，但其保护作用的具体机制需进一步的研究。

RIR后造成肝组织中性粒细胞集聚与激活，阻塞微血管，肝脏微循环障碍，产生“无复流现象”，并且产生大量自由基及释放各种炎性物质，这可能是导致肝脏损伤的原因之一。大量的NO通过刺激中性粒细胞释放氧自由基，引起氧自由基大量生成，加重组织炎症反应，对组织细胞产生损伤；其还可作用于血管内皮细胞、组织细胞等破坏血管壁的完整性，进而造成组织器官的功能障碍与损伤。MPO是中性粒细胞和单核细胞氧依赖性杀菌系统的重要组分，可形成具有氧化能力的自由基，检测MPO水平能反应组织中中性粒细胞聚集的数量和活化程度。ICAM-1是一种细胞表面糖蛋白。众多研究发现，ICAM-1介导了中性粒细胞与血管内皮细胞之间的黏附，而中性粒细胞与血管内皮细胞之间的黏附则是中性粒细胞聚集、活化和释放炎性介质的关键。本文结果显示，与对照组比较，模型组NO、MPO升高，ICAM-1表达增强。提示在RIR发生后，ICAM-1表达增加导致大鼠肝内大量中性粒细胞聚集，造成微血管阻塞，NO大量增加刺激中性粒细胞产生大量自由基及释放各种炎症因子，造成肝的损伤。本文结果还显示，实验组NO高于模型组，而MPO、ICAM-1表达低于模型组。提示LA可以下调ICAM-1的表达来抑制中性粒细胞与血管内皮细胞的黏附，减少RIR后中性粒细胞在肝组织内的积聚，减轻肝损伤。而使用LA后NO水平持续升高，其机制有待于进一步研究。

肝缺血再灌注损伤时产生的ROS及炎症因子可导致肝细胞凋亡。因此，推测肝细胞凋亡可能是一个RIR后造成肝损伤的原因。研究证明，凋亡发生是一个复杂的、由Caspase家族成员介导的蛋白酶级联反应过程，而该家族成员Caspase-3是哺乳动物凋亡过程中的关键蛋白酶。Hsps是在生理应激或病理状态等环境因素刺激下于细胞内诱导合成的高度保守的多肽类蛋白质分子家族。Hsp70对细胞有明确的内源性保护作用，其成为Hsps中最受关注、研究最深入的一种。正常细胞Hsp70少量存在，创伤后、缺血缺氧及炎性因子等不良刺激导致其合成增加。有研究表明，Hsp70对细胞凋亡的死亡受体通路和线粒体通路也有抑制作用。本研究显示，与对照组比较，模型组Caspase-3表达增强，Hsp70表达降低。提示RIR后，各种因素可刺激肝细胞凋亡蛋白酶级联反应发生，降低肝细胞内源性保护蛋白的酶活性，减轻Hsp70对细胞及线粒体凋亡的抑制作用，加重肝细胞损伤。本研究还显示，与模型组比较，实验组Caspase-3表达降低，Hsp70表达升高。提示外源性补充LA可以明显减轻RIR导致的肝细胞凋亡，其机制可能是LA通过抑制Caspase-3表达和促进Hsp70表达来保护肝脏。

总之，LA可能通过抗氧化、保护线粒体、抑制炎症因子和抗凋亡等途径实现对RIR后肝损伤的防治作用。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.47.009

R363

A

1002-266X(2017)47-0031-04

国家自然科学基金资助项目(81600316)；大学生创新课题(X2017179)。

张伟(E-mail: zhangwei6_ren@163.com)

2017-07-31)