鞘氨醇激酶1对人骨肉瘤U2OS细胞增殖、凋亡的影响及机制

张万贺，宝琪，杜春阳，郭义超

(1保定市莲池区妇幼保健院，河北保定071000；2保定市骨科医院；3河北医科大学)

·基础研究·

鞘氨醇激酶1对人骨肉瘤U2OS细胞增殖、凋亡的影响及机制

张万贺1，宝琪2，杜春阳3，郭义超2

(1保定市莲池区妇幼保健院，河北保定071000；2保定市骨科医院；3河北医科大学)

目的探讨鞘氨醇激酶1(SphK1)对人骨肉瘤U2OS细胞增殖和凋亡的影响及机制。方法将体外培养的人骨肉瘤U2OS细胞随机分为四组，转染组、Vector组分别转染SphK1 siRNA及对照siRNA，PF-543组在培养液中加入1 μmol/L SphK1特异性抑制剂PF-543，对照组常规培养。干预48 h时，采用Western blotting法检测SphK1蛋白表达，明确siRNA转染可在蛋白水平抑制骨肉瘤U2OS细胞SphK1高表达，且效果与其抑制剂PF-543相当。采用MTT法检测各组细胞存活率，采用TUNEL法和流式细胞术检测细胞凋亡率，采用Western blotting法检测增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、Bax、Bcl-2、Caspase-3及活化的Caspase-3(cleaved Caspase-3)蛋白表达。结果与对照组、Vector组比较，转染组、PF-543组细胞存活率均下降，细胞凋亡率均增加，PCNA、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达均减低，Bax、Caspase-3及cleaved Caspase-3蛋白表达均增加，组间比较P均<0.05。结论SphK1基因可促进骨肉瘤细胞增殖、抑制细胞凋亡，调节凋亡及增殖相关因子表达可能是其作用机制。

骨肉瘤；鞘氨醇激酶1；细胞增殖；细胞凋亡；鞘氨醇激酶1特异性抑制剂

骨肉瘤是儿童及青少年常见的高度恶性骨组织原发肿瘤，年发病率为2/100万～5/100万，好发于血运丰富的长骨干骺端，具有早期肺转移、复发率高等特点，患者预后较差[1～3]。鞘氨醇激酶1(SphK1)可将具有促细胞凋亡功能的鞘氨醇(Sph)磷酸化为具有促细胞存活功能的鞘氨醇1-磷酸(S1P)，进而调控细胞的生长发育[4]。Zhou等[5]研究发现，microRNA-124(miRNA-124)可通过下调人骨肉瘤细胞SphK1表达抑制细胞增殖及侵袭；苯妥帝尔和阿霉素联合应用能够抑制骨肉瘤组织SphK1高表达，同时抑制骨肉瘤U2OS细胞生长发育[6]。上述研究结果提示，SphK1可能参与骨肉瘤的发病及其病理生理过程，但其作用机制尚不明确。2016年3月～2017年3月我们进行本研究，探讨SphK1对人骨肉瘤U2OS细胞增殖、凋亡的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人骨肉瘤U2OS细胞购自南京凯基生物科技发展有限公司。SphK1 siRNA购自美国Santa Cruz公司。SphK1特异性抑制剂PF-543购自美国Selleck Chemicals公司。兔抗SphK1、Bcl-2、Caspase-3、活化的Caspase-3(cleaved Caspase-3)、增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)多克隆抗体及小鼠抗Bcl-2相关X蛋白(Bax)单克隆抗体均购自美国Promega公司。MTT购自Sigma公司。脂质体2000购自美国Invitrogen公司。辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司。聚偏二氟乙烯膜(PVDF)购自美国Milipore公司。TUNEL试剂盒购自美国Promega公司。

1.2 细胞培养 将U2OS细胞在DMEM完全培养基中37 ℃常规培养，当细胞融合75%～85%时，用无血清培养基培养24 h，进行以下研究。

1.3 细胞分组处理 将细胞随机分为四组，其中转染组、Vector组分别采用脂质体2000转染SphK1 siRNA及对照siRNA，PF-543组在培养液中加入1 μmol/L SphK1特异性抑制剂PF-543，对照组常规培养。

1.4 相关指标观察

1.4.1 细胞SphK1蛋白表达 采用Western blotting法检测。将四组转染48 h的细胞用冰冷PBS洗2遍，加入细胞裂解液200 μL，冰上放置1 h，4 ℃、12 000 r/min离心25 min，取上清液置于一干净的EP管中，Lowry法测定总蛋白浓度。取细胞裂解蛋白50 μg，行SDS-PAGE电泳，将产物电转移至PVDF膜；5%脱脂奶粉封闭PVDF膜2 h，加入SphK1抗体，4 ℃冰箱过夜；TBST液洗膜3次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠或兔抗体，37 ℃孵育1.5 h；TBST液洗膜后加ECL试剂，ODYSSEY远红外双色荧光成像系统显影(LLCOR Gene Company，USA)。LabWorks4.5软件(UVP Company，USA)对蛋白条带进行定量分析。

1.4.2 细胞增殖情况 采用MTT法检测。将细胞(5×103个/mL)接种于96孔板，每孔定容为200 μL，分别加入200 μL(5 g/L)MTT，37 ℃培养箱中继续培养4 h；弃培养液，每孔分别加入150 μL DMSO，待结晶完全溶解；采用酶标仪检测各孔在490 nm波长处的吸光度(A)值，计算细胞存活率。细胞存活率=(处理组A值/对照组A值)×100%。

1.4.3 细胞凋亡率 ①采用TUNEL法检测。将细胞(6×103个/mL)接种于8孔Leb-Tak腔室波片(美国Nalge Nunc公司)采用TUNEL法检测阳性细胞。步骤严格按试剂盒说明书操作。阳性细胞核呈棕黄色。每孔至少计数500个细胞，计算细胞凋亡率。细胞凋亡率=(凋亡细胞数/总细胞数)×100%。②采用流式细胞术检测。收集细胞培养液中的悬浮细胞及贴壁细胞，预冷PBS冲洗两次，采用体积分数为70%的冰冷乙醇固定24 h，置于4 ℃冰箱；取出后PBS冲洗两次，碘化丙啶4 ℃避光染色30 min，采用流式细胞仪检测凋亡细胞数，计算细胞凋亡率。

1.4.4 PCNA、Cyclin D1、Bax、Bcl-2、Caspase-3及cleaved Caspase-3蛋白表达 采用Western blotting法检测。具体步骤参照1.4.1。

2 结果

2.1 各组SphK1蛋白表达比较 转染组、Vector组、PF-543组、对照组SphK1蛋白相对表达量分别为0.16±0.03、0.91±0.02、0.32±0.01、0.98±0.02。转染组、PF-543组SphK1蛋白相对表达量较对照组及Vector组明显降低(P均<0.05)，其余组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。

2.2 各组细胞存活率比较 转染组、Vector组、PF-543组、对照组细胞存活率分别为(45.17±0.21)%、(92.00±0.02)%、(53.05±0.26)%、(98.04±0.01)%。与对照组、Vector组比较，转染组、PF-543组细胞存活率均下降(P均<0.01)；其余组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。

2.3 各组细胞凋亡率比较 流式细胞结果显示，转染组、Vector组、PF-543组、对照组细胞凋亡率分别为(54.81±0.15)%、(8.20±0.03)%、(47.31±0.16)%、(2.57±0.02)%。与对照组及Vector组比较，转染组、PF-543组细胞凋亡率均升高(P均<0.01)；其余组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。

TUNEL结果显示，转染组、Vector组、PF-543组、对照组细胞凋亡率分别为(47.32±0.16)%、(4.35±0.05)%、(41.13±0.41)%、(4.82±0.06)%。与对照组和Vector组比较，转染组、PF-543组细胞凋亡率均升高(P均<0.01)；其余组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。

2.4 各组PCNA、Cyclin D1、Bax、Bcl-2、Caspase-3及cleaved Caspase-3蛋白表达比较 与对照组和Vector组比较，转染组、PF-543组PCNA、Cyclin D1、Bcl-2蛋白相对表达量均降低，Bax、Caspase-3及cleaved Caspase-3蛋白相对表达量均升高，组间比较P均<0.05。见表1。

表1 各组细胞PCNA、Cyclin D1、Bax、Bcl-2、Caspase-3及 cleaved Caspase-3蛋白相对表达量比较

注：与对照组比较，*P<0.01；与Vector组比较，*P<0.01。

3 讨论

80%的骨肉瘤患者在确诊时已经发生转移，手术及新辅助化疗后5年生存率仅20%～30%[7,8]。骨肉瘤临床治疗效果不佳的重要原因是缺少特异性的分子治疗靶点[9]。SphK1是维持细胞内鞘脂平衡的重要调节酶，具有SphK1和SphK2两个亚型，虽然二者在结构域上高度保守，但在亚细胞定位、酶催化特性和组织表达谱等方面均显著不同。SphK1是1-磷酸鞘氨醇(S1P)生成的限速酶，通过降低组织内神经酰胺和鞘氨醇含量，促进细胞增殖、抑制细胞凋亡[3]。研究发现，SphK1在肿瘤组织中表达明显高于正常组织，如结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、头颈部鳞癌及甲状腺癌等[10,11]。Bonhoure等[12]报道，特异性敲除人类白血病细胞系SphK1基因能够抑制线粒体细胞色素C的释放，进而促进细胞凋亡。Heffernan-Stroud等[13]报道，敲除SphK1基因可以抑制p53基因敲除小鼠特征性胸腺淋巴瘤的发生、发展。SphK1表达水平与肿瘤恶性程度和患者预后等临床病理特征相关，因此SphK1被认为是生物体内重要的致癌因子。新近有报道称，SphK1参与骨肉瘤的发病及其病理生理过程。彭晶等[4]研究发现，mi-124通过下调人骨肉瘤细胞SphK1表达抑制细胞的增殖及侵袭。苯妥帝尔和阿霉素联合应用同样能够抑制骨肉瘤组织SphK1高表达，进而抑制骨肉瘤U2OS细胞的生长发育[5]。本研究采用短链microRNA和特异性抑制剂两种手段敲低人骨肉瘤U2OS细胞SphK1表达，结果显示，SphK1表达被抑制后U2OS细胞增殖受到明显抑制，提示SphK1基因可能是骨肉瘤的靶基因。

肿瘤防治的关键是抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡。细胞凋亡是细胞接受内外源死亡信号刺激后发生的自杀性死亡，在调节生物生长发育和自身稳定方面发挥重要作用。目前临床上大多数抗肿瘤药物的作用机制是诱导肿瘤细胞凋亡。研究发现，SphK1在许多哺乳动物肿瘤细胞中发挥抗细胞凋亡作用[14]。有研究以病毒为载体，将野生型和突变型SphK1基因导入人胃癌细胞，结果显示，过表达SphK1可抑制5-FU诱导的胃癌细胞凋亡[14]；干扰乳腺癌MCF-7细胞SphK1基因表达可以抑制肿瘤细胞增殖和迁移能力，同时诱导细胞发生凋亡[15,16]。本研究发现，SphK1表达被抑制后骨肉瘤U2OS细胞凋亡率升高，凋亡细胞数明显增加；同时细胞内重要的凋亡抑制基因Bcl-2蛋白表达明显降低，促凋亡发生基因Caspase-3、cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达明显升高。提示在骨肉瘤发病过程中，SphK1基因通过调节凋亡相关因子表达抑制肿瘤细胞凋亡。PCAN及Cyclin D1是细胞增殖状态的重要评价指标，其在肿瘤组织中的表达变化对疾病的发生、发展及患者预后具有关键性评估价值。本研究中SphK1表达被抑制后骨肉瘤U2OS细胞PCNA及Cyclin D1表达均受到明显抑制，提示SphK1基因可能通过调控细胞增殖因子表达促进骨肉瘤细胞增殖。

综上所述，SphK1基因具有促进骨肉瘤细胞增殖、抑制细胞凋亡的作用；调节凋亡及增殖相关因子表达可能是其作用机制。SphK1基因可能成为骨肉瘤的治疗靶点。

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河北省教育厅青年基金项目(QN2016018)。

宝琪(E-mail: 13731697766@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.48.008

R738.1

A

1002-266X(2017)48-0028-03

2017-06-26)