异功散对小鼠慢性病贫血的治疗作用

郑 秦, 姜一陵, 季玉婷, 夏乐敏, 张爱萍, 石 岭, 戴程怡, 薛 城, 邹纯朴, 罗梅宏

(1. 上海市宝山区中西医结合医院暨上海中医药大学附属曙光医院宝山分院血液科, 上海 201999;2. 上海中医药大学基础医学院内经教研室, 上海 201203)

·论 著·

异功散对小鼠慢性病贫血的治疗作用

郑 秦1, 姜一陵1, 季玉婷1, 夏乐敏1, 张爱萍1, 石 岭1, 戴程怡1, 薛 城1, 邹纯朴2, 罗梅宏1

(1. 上海市宝山区中西医结合医院暨上海中医药大学附属曙光医院宝山分院血液科, 上海 201999;2. 上海中医药大学基础医学院内经教研室, 上海 201203)

目的观察异功散(YGS)对慢性病贫血(ACD)小鼠的治疗作用。方法取8周龄雄性C57BL/6小鼠，腹腔注射脂多糖(0.5 mg/mL), 第6 d腹腔注射酵母糖A(32 mg/mL)，第11 d模型小鼠随机分为模型组、中药干预组，另设空白对照组。当日起给予药物干预，中药干预组灌胃YGS水煎液，剂量为每日15.413 g/kg生药; 空白对照组、模型组灌胃0.2 mL超纯水。采集外周血、肝、脾组织, 采用自动细胞计数仪检测小鼠血常规; 比色法检测血清铁(SI)、未饱和铁结合力(UIBC);ELISA法检测铁蛋白(SF); 普鲁士蓝染色观察肝、脾组织铁，采用Image-Pro Plus 6.0软件分析普鲁士蓝铁离子阳性面积百分比，RT-PCR检测小鼠肝脏铁调素基因(HAMP) mRNA的表达。结果与模型组比，连续给药1周和2周后中药干预组小鼠血红蛋白(HB)、红细胞计数(RBC)、红细胞比容(HCT)均有显著提高(P＜0.01或P＜0.05)，红细胞压积(MCV)无明显改善(P＞0.05), 血清SI和UIBC也明显上升(P＜0.01或P＜0.05), 血清SF及肝、脾组织铁含量显著降低(P＜0.01或P＜0.05),肝脏HAMP mRNA显著下降(P＜0.01或P＜0.05)。结论YGS可以改善ACD小鼠贫血，调节其铁代谢的紊乱，这一作用可能与其对铁调素的下调有关。

慢性病贫血(ACD); 异功散(YGS); 治疗; 铁调素

慢性病贫血(ACD)即炎性贫血，是指急性或慢性炎症相关的疾病引起的贫血，这些疾病包括感染性疾病(细菌、真菌、病毒)，非感染性疾病(自身免疫性疾病、肿瘤、慢性肾病、心衰、肥胖等)，甚至老化(前炎症过程)[1]。目前ACD已成为住院病人最常见的贫血类型，其发病率仅次于缺铁性贫血[2]。ACD是铁代谢相关疾病，其主要病理特点之一是，铁过多贮存于单核巨噬系统，不能循环再利用，导致可利用的铁减少，红细胞生成不足而出现贫血。结合中医理论有关“脾主运化”及“脾为气血生化之源”等理论，我们认为作为精微物质的铁，要通过“脾主运化”才得以正常输布、利用，“脾主运化”参与机体的整个铁代谢过程。因此，应用“运脾法”可实现铁在体内的重新分布，即促进单核巨噬系统内的铁释放入血，以满足造血所需，从而改善贫血[3]。异功散(YGS)是“运脾法”代表方剂，其中的陈皮意在行气化滞，醒脾助运的作用，使该方剂具有补而不滞、补中有行的优点，临床用于ACD治疗，可起到促进铁循环再利用的作用，因此较之单纯的健脾补肾生血收效更佳。为探讨YGS调节ACD铁代谢的作用机制，我们观察了YGS对ACD模型小鼠的血液学、铁代谢的影响及其与铁调素(Hepcidin)的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级8周龄雄性C57BL/6小鼠(20 g左右)，购自上海斯莱克实验动物有限公司[SCXK(沪)2012-0002]，饲养于屏障设施的IVC饲养笼中(IVC-Ⅱ型，苏州市冯氏实验动物设备有限公司)。

1.2 试剂和仪器

脂多糖(LPS)(美国Sigma公司, 批号: L2755)、酵母糖A(美国Sigma公司，批号: Z4250)、血清铁检测试剂盒(美国Pointe Scientific公司，批号:MI48188)、小鼠铁蛋白ELISA试剂盒(美国ICL Lab公司, 批号E-90F)、普鲁士蓝(PB)染液(武汉赛维尔生物科技有限公司, 批号: G1029)、BAY 120型全自动细胞计数仪(德国西门子公司)、Nano Drop 200型微量紫外分光光度计(美国Thermo公司)、ECLIPSE Ci型生物正置显微镜(日本Nikoni公司)、EMuleC7超薄切片机(美国Thermo公司)、CFX96 RT-PCR 仪器(美国Bio-Rad公司)。

1.3 药物

YGS 组方: 生晒参(去芦)40 g, 产地: 吉林，上海雷允上中药饮片厂, 批号: 1607229; 炒白术40 g,产地: 浙江, 上海雷允上中药饮片厂, 批号: 1606097;白茯苓(去皮)40 g，产地: 安徽，上海雷允上中药饮片厂，批号: 1606096; 蜜炙甘草40 g，产地: 新疆，上海雷允上中药饮片厂，批号: 1603118; 陈皮40 g, 产地: 浙江，上海雷允上中药饮片厂，批号: 1607129，用 8 倍水加减煎煮2 次，每次 1 h，合并滤液, 调整 pH 值至中性, 180 ℃蒸馏浓缩定容至 100 mL, 60 ℃真空加压干燥，粉碎成100目粉，由上海中医药大学药学院制备，常温干燥保存。

1.4 方法

1.4.1 造模 按照文献方法复制模型[4]， 小鼠经适应性饲养3 d后，先按0.1 mL/10g体质量的剂量，给小鼠腹腔注射LPS溶液(0.5 mg/mL)后6 d，再按0.25 mL/10g，腹腔注射酵母糖A溶液(32 mg/mL)后5 d，造模成功，成功率约80%。

1.4.2 分组及干预方法按随机数字表法将48只C57 BL/6小鼠随机分为3组, 分为空白对照组、模型组、中药干预组, 每组各16只, 每组于连续给药1周及2周后，分别处死8只。YGS按临床常用量由人参(去芦)15 g、白术 15 g、茯苓(去皮)15 g、炙甘草 15 g、陈皮15 g 组成。给药剂量参照《药理实验方法学》[5]中人和小鼠间按体表面积折算的等效剂量比值估算为15.413 g生药/kg/d，中药配置终浓度为1.5413 g/mL的水溶液, 按0.01 mL/g给中药干预组灌胃。空白对照组、模型组每只灌胃0.2 mL超纯水，采集外周血、肝、脾组织标本。

1.4.3 观察指标及方法

1.4.3.1 血液学指标 经眼眶后静脉丛采集约400 μL全血, 置于EDTA抗凝微量采血管内, 送至上海市食品药品检测所药理毒理实验室，使用动物专用自动细胞计数仪检测血红蛋白(Hb)等部分血液学指标。

1.4.3.2 血液生化指标的检测 经眼眶后静脉丛采集全血约200 μL于微量血清分离管内, 3 000 r/min,25 min，4℃分离血清，约40 μL。按依照试剂说明书，比色法检测血清铁(SI)、未饱和铁结合力(UIBC)、ELISA法检测铁蛋白(SF)。

1.4.3.3 肝、脾组织PB染色 肝、脾组织样本固定在质量分数4%多聚甲醛，石蜡包埋, 然后切片,4 mm×11 mm×1 mm, PB染色, 显微境观察并采集图像。Image-Pro Plus 6.0软件分析PB铁离子阳性面积百分比(含铁血红素)方法: 每组内每张切片在200倍视野下进行拍照。拍照时尽量让组织充满整个视野, 保证每张照片的背景光一致。应用Image-Pro Plus 6.0软件对每张照片进行分析得出每张照片蓝色铁离子占整个组织面积的比率即PB阳性面积百分比。

1.4.3.4 荧光实时定量PCR检测 首先, 使用RNAiso Plus 试剂盒(D9108A, 日本TaKaRa公司)，按说明书提取肝组织RNA; 然后使用PrimeScript试剂盒(日本TaKaRa公司)，按说明书在RT-PCR仪器反转录RNA; 进而使用SYBR Premix Ex试剂盒(DRR420A,美国Bio-Rad公司)，按说明书在RT-PCR仪器检测β-actin, 铁调素基因(HAMP) mRNA表达, β-actin作为内参。

β-actin引物序列

上游: 5'-AGCTGAGAGGAAATCGTGCG-3';

下游: 5'-GTGCCACCAGACAGCACTGTG-3';

HAMP mRNA引物序列

上游: 5'-AGCACCACCTATCTCCATCAAC-3';

下游: 5'-TGTCTCTCTTCCTTCTCTTCTGC-3'

1.5 统计学方法

数据采用SPSS 22.0分析软件进行统计分析。计量资料数据以x-± s表示。经方差齐性检验, 方差齐的数据, 多组间比较采用单因素方差分析, 两两比较采用LSD 检验, P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 异功散可以改善ACD小鼠贫血

如表1, 与空白对照组比，模型组小鼠血红蛋白(HB)、红细胞计数(RBC)、红细胞比容(HCT)、红细胞压积(MCV)水平均显著下降(P＜0.01); 与模型组比, 连续给药1周及2周后，中药干预组小鼠HB、RBC、HCT含量均显著提高(P＜0.01或P＜0.05)，MCV无明显改变(P＞0.05)。

2.2 异功散可调节ACD小鼠铁代谢

2.2.1 异功散可提高ACD小鼠外周血可利用铁水平与空白对照组相比, 模型组SI、UIBC明显下降(P＜0.01或P＜0.05), SF明显升高(P＜0.01或P＜0.05);与模型组相比, 连续给药1周及2周后，中药干预组小鼠SI、UIBC的含量显著提高(P＜0.01或P＜0.05),SF 明显降低(P＜0.01或P＜0.05)(表2)。

表 1 各组小鼠部分血液学指标变化

表 2 各组小鼠外周血铁代谢指标变化

2.2.2 异功散可以降低ACD小鼠脾组织铁含量 与空白对照组比，模型组小鼠脾组织铁含量均明显升高(P＜0.05); 与模型组比，连续给药1周及2周后，中药干预组小鼠脾组织铁含量均显著下降(P＜0.01)(表 3、图 1)。

表 3 各组小鼠脾铁含量变化 %

2.2.3 异功散可降低ACD小鼠肝组织铁含量 与空白对照组比，模型组小鼠肝组织铁含量均明显升高(P＜0.01或P＜0.05); 与模型组比, 连续给药1周及2周后，中药干预组肝组织铁含量显著下降(P＜0.01)(表 4, 图 2)。

2.2.4 异功散可降低ACD小鼠肝HAMP mRNA表达 与空白对照组比，模型组小鼠肝组织HAMP mRNA的相对表达量均明显升高(P＜0.01); 与模型组比, 连续给药1周及2周后, 中药干预组肝组织HAMP mRNA的相对表达量显著下降(P＜0.01或P＜0.05)(表 5)。

3 讨论

中医没有ACD的病名，通常将其与缺铁性贫血一并归属于“萎黄”、“黄病”或“血虚证”等范畴。然而，与缺铁性贫血不同，ACD所表现的低铁血症不是由于铁的供应不足，而是由于铁的吸收、利用等应答过程失调，导致供应的铁不能被吸收入血、贮存的铁不能动员入血进行再利用即铁稳态失衡。这一病理特点提示，ACD不是单纯的健脾补肾所能凑效的疾病。据此, 课题组提出[3]“受气取汁, 变化而赤”是脾正常调节铁代谢的过程，ACD 的病理环节是“中焦受气取汁”的过程受损; 脾有运化“水湿精微”的功能, 铁是体内的精微物质之一，铁代谢紊乱反映的是脾运失常，临床应以“运脾”法恢复其功能。YGS是由四君子汤加味而成，方中“参、术、苓、草, 甘温益胃, 有健运之功, 具冲和之德”(《名医方论》)，加陈皮意在行气化滞，醒脾助运，有补而不滞、补中有行的优点，为运脾立法之良方。铁作为精微物质，需依赖“脾运”之功在机体内正常运转分布，发挥其功能。异功散之“补中有行”的特点使得该方能参与铁的整个代谢过程，尤其是铁的动员、循环和再利用。

图 1 各组小鼠脾组织铁(PB×400)

图 2 各组小鼠肝组织铁(PB×400)

表 4 各组小鼠肝组织铁含量变化 %

表 5 各组小鼠肝组织HAMP mRNA的相对表达量

目前认为，铁调素是机体调节铁代谢的核心蛋白, 在ACD 发病机制中起着至关重要的作用[6,7]。铁调素是在肝脏中由HAMP 基因编码的小分子肝肽,是维持机体铁稳态的关键。其主要在炎症、缺氧、铁过载等情况下抑制小肠对铁的吸收, 促进巨噬细胞对铁的摄入, 从而调节铁的吸收和循环[8-11]。前期我们观察了YGS对炎症介导的小鼠体内铁代谢紊乱的作用。进一步研究发现[12,13]，YGS对正常小鼠铁代谢并没有影响，但能通过降低炎症介导的小鼠血清IL-6的升高，抑制肝脏铁调素表达，改善血清低铁状态，纠正肝组织铁贮存过多。由此我们推测异功散可通过抑制铁调素的过表达来调节炎症介导的铁代谢紊乱。那么异功散是否可以通过抑制铁调素的过表达来调节ACD铁代谢紊乱从而纠正贫血呢？为回答这一问题，本研究选用了公认的ACD小鼠模型[4,14]观察研究异功散对ACD小鼠模型的治疗作用。

文献[4]及我们的预实验结果均表明，注射酵母糖A 5 d后小鼠HB、RBC、HCT、MCV开始明显降低，SI减少，SF升高，表现出典型ACD的病理特征改变。因此，我们在造模第5日起给药，连续给药1周或2周，观察中药的作用。虽然MCV无明显变化，但HB、RBC、HCT均明显提高，说明异功散可以改善ACD小鼠贫血。

机体内16%的铁以铁蛋白及含铁血黄素形式储存于肝、脾及骨髓中[15]，ACD时铁过多地蓄积于肝、脾等系统内，不能循环再利用，导致可利用的循环铁减少，导致贫血。如果能将此部分铁动员再利用，恢复铁的正常分布，那么就有可能使ACD得到根本的治疗。虽然目前骨髓铁仍是评价机体储存铁的金标准，然而临床上由于取材欠佳等原因，约有20%骨髓标本不能对机体存储铁做出正确的判定，因此临床上常采用SF评估机体储存铁的情况[16]。已有研究表明[17]，骨髓铁与SI、SF呈正相关; 与UIBC呈负相关。由此可见，SI、UIBC、SF可以很好地评价机体铁代谢的情况。本文研究表明，ACD小鼠肝脏HAMP mRNA表达升高, 血清中SI、UIBC下降, SF升高, 肝脾组织铁增高，给予异功散干预后，小鼠肝脏HAMP mRNA表达相对下降，血清SI、UIBC显著增加，SF及肝脾组织铁明显减少。由此推测，异功散可以通过降低铁调素的表达，从而动员肝、脾组织内的储铁向外周血转移，提升循环中可利用的铁水平,以供造血所需，增加红细胞生成，改善贫血。

本实验结果已初步证明，异功散通过降低铁调素的过表达从而调节铁代谢的紊乱，改善贫血，为开展进一步的研究，阐明诸如药效关系、药效成分及作用机理等科学问题，赋予该方应用于临床的更多科学依据，具有实际的临床意义。另外, 本研究中, 无论是连续给药1周还是2周, 异功散均可以调节ACD小鼠铁代谢，改善贫血，两者并没有明显的差异，可能异功散的效价的提高并不在于时间的延长，而在于药物浓度的改变。因此，后续的工作，我们将改变给药浓度，进一步探寻异功散治疗ACD最佳浓度及相关的作用机制。

[1] Poggiali E, Migone De Amicis M, Motta I, et al. Anemia of chronic disease: a unique defect of iron recycling for many different chronic diseases [J]. Eur J Intern Med, 2014, 25(1):12-17.

[2] Fraenkel PG. Understanding anemia of chronic disease[J].Hematology Am Soc Hematol Educ Program, 2015, 2015: 14-18.

[3] 罗梅宏. 从脾主运化和运脾生血理论探讨慢性病贫血的中医病机和治疗[J]. 中医杂志, 2013, 54(18):1556-1557.

[4] Lasocki S, Millot S, Andrieu V, et al. Phlebotomies or erythropoietin injections allow mobilization of iron stores in a mouse model mimicking intensive care anemia[J]. Crit Care Med, 2008, 36(8):2388-2394.

[5] 徐叔云. 药理实验方法学[M]. 北京: 人民卫生出版社,2002:20.

[6] Theurl I, Aigner E, Theurl M, et al. Regulation of iron homeostasis in anemia of chronic disease and iron deficiency anemia: diagnostic and therapeutic implications[J]. Blood,2009, 113(21):5277-5286.

[7] Sun CC, Vaja V, Babitt JL, et al. Targeting the hepcidinferroportin axis to develop new treatment strategies for anemia of chronic disease and anemia of inflammation[J]. Am J Hematol, 2012, 87(4):392-400.

[8] Rochette L, Gudjoncik A, Guenancia C, et al. The ironregulatory hormone hepcidin: a possible therapeutic target?[J]. Pharmacol Ther, 2015, 146:35-52.

[9] Singh B, Arora S, Agrawal P, et al. Hepcidin: a novel peptide hormone regulating iron metabolism[J]. Clin Chim Acta, 2011,412(11-12):823-830.

[10] Ward DM, Kaplan J. Ferroportin-mediated iron transport:expression and regulation[J]. Biochim Biophys Acta, 2012,1823(9):1426-1433.

[11] Silva B, Faustino P. An overview of molecular basis of iron metabolism regulation and the associated pathologies[J].Biochim Biophys Acta, 2015, 1852(7):1347-1359.

[12] 郑秦, 管宇, 王志成, 等. 异功散对脂多糖介导的小鼠铁代谢紊乱的影响[J]. 中医杂志, 2015, 56(20):1767-1770.

[13] Zheng Q, Guan Y, Xia L, et al. Effect of Yi Gong San decoction on iron homeostasis in a mouse model of acute inflammation[J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2016, 2016:2696480.

[14] Rivera S, Ganz T. Animal models of anemia of inflammation[J]. Semin Hematol, 2009, 46(4):351-357.

[15] 郁敏燕, 朱俐. 低氧与铁代谢相关蛋白[J]. 中国生物化学与分子生物学报, 2012(10):897-905.

[16] 彭碧, 曾白华, 陈小红. 铁代谢相关血清学指标在贫血诊断中的应用价值[J]. 国际检验医学杂志, 2014(5):552-554,556.

[17] 魏小平, 马泽荣, 郑贵星, 等. 骨髓铁与常用血清铁指标的相关性研究[J]. 国际检验医学杂志, 2011(14):1546-1547,1549.

Therapeutic Effects of Yi Gong San Decoction on Anemia of Chronic Disease in Mouse

ZHENG Qin1, JIANG Yi-ling1, JI Yuting1, XIA Le-ming1, ZHANG Ai-ping1,SHI Ling1, DAI Cheng-yi1, XUE Cheng1, ZOU Chun-pu2, LUO Mei-hong1

(1. Department of Hematology, Shanghai Baoshan Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine (Baoshan Branch of Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine), Shanghai 201900, China; 2. Neijing Department, School of Basic Medical Science, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China)

ObjectiveTo observe the therapeutic effects of Yi Gong San decoction (YGS) on anemia of chronic disease (ACD) in mouse.MethodsTotally 48 male 8-week-old male C57 BL/6 mice were randomly divided into blank control group, model group, intervention group. Each group was sacrificed 8 mouse after the continuous administration of 1 week or 2 weeks. The model group and intervention group intraperitoneally injected with zymosan A after 6 days of intraperitoneally injected with LPS. After 5 days of zymosan A injection, YGS (15.413 g per day) was administered to mice intragastrically in intervention group for successive 1 or 2 weeks while 0.2 mL of ultra-pure water was administered to mice intragastrically in blank control group and the model group. The mouse blood routine was measured by automatic cell counting. Colorimetric method was used to detect serum iron (SI) and unsaturated iron binding (UIBC). ELISA was used to detect ferritin (SF). The ratio of iron in liver and spleen were analyzed by software using Prussian blue staining. The positive area of Prussian blue iron was analyzed by Image-Pro Plus 6.0 software. The expression of hepcidin antimicrobial peptide (HAMP) mRNA in mouse liver was detected by RT-PCR.ResultsIn the 1 or 2 weeks, the content of hemoglobin (HB),erythrocyte count (RBC), hematocrit (HCT) in mice was significantly increased (vs model group, P＜0.01 or P＜0.05); Hematocrit (MCV) was not changed (P＞0.05). The SI and UIBC was increased (VS model group, P＜0.01 or P＜0.05); the SF and the ratio of iron in liver and spleen reduced significantly(VS model group, P＜0.01or P＜0.05). Liver HAMP mRNA was significantly decreased (P＜0.01 or P＜0.05).ConclusionYi Gong San decoction can improve the degree of anemia and adjust the iron metabolism disorder in mouse of anemia of chronic disease by decreasing HAMP mRNA relative expression.

Anemia of chronic disease (ACD); Yi Gong San decoction (YGS); Treatment; Hepcidin

Q95-33

A

1674-5817(2017)06-0421-07

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.06.001

2017-08-10

国家自然科学基金青年项目(81102569), 国家自然基金面上项目(81774271), 上海卫生和计划生育委员会科研项目(201440587), 上海市自然科学基金面上项目(16ZR1425400)

郑 秦(1986-), 硕士研究生, 住院医师, 主要研究方向: 中医药治疗血液病的临床与实验研究。

E-mail: 670251899@qq.com

邹纯朴(1971-), 医学博士, 副教授, 硕士研究生导师, 主要研究方向: 内经理论临床应用。

E-mail: chunpuzou@shutcm.edu.cn

罗梅宏(1971-), 医学博士, 主任医师, 硕士研究生导师, 主要研究方向: 中医药治疗血液病的临床与实验研究。E-mail:lmh021009@163.com