实验用斑马鱼成鱼内脏组织病理学检查方法的优化

田 芳, 王玉柱, 夏敏杰, 孙 冰, 丁训城, 李卫华, 许慧慧, 胡晶莹

(1. 上海市计划生育科学研究所, 国家计划生育药具重点实验室, 上海 200032;2. 上海市疾病预防控制中心, 上海 200336)

实验用斑马鱼成鱼内脏组织病理学检查方法的优化

田 芳1, 王玉柱1, 夏敏杰1, 孙 冰1, 丁训城1, 李卫华1, 许慧慧2, 胡晶莹1

(1. 上海市计划生育科学研究所, 国家计划生育药具重点实验室, 上海 200032;2. 上海市疾病预防控制中心, 上海 200336)

目的探索并优化适合于斑马鱼成鱼内脏组织的病理学检查技术。方法将斑马鱼整条固定于Dietrich’s固定液后，分段切开，取包含内脏组织的胸腹段，剥除斑马鱼鱼皮，梯度乙醇脱水时间优选为30 min、二甲苯透明、石蜡包埋、沿斑马鱼体轴纵向连续切片、HE染色后用温水冲洗切片进行颜色反蓝，正置显微镜下观察效果。结果经过反复的条件摸索和优化，光学显微镜下观察心脏、肝脏、脾脏、胆囊、肾脏、胰腺、消化道、精巢和卵巢等组织切片和染色的效果，可见斑马鱼组织均切片完整，无折叠或断裂，各脏器的解剖学与组织细胞学结构清晰，易于辨认，细胞核与细胞质染色分明。结论优化后的斑马鱼成鱼内脏组织病理学方法效果较为理想，可获得高质量的内脏组织学标本。

斑马鱼; 内脏组织; 连续切片; HE染色

斑马鱼(Zebrafish, Danio rerio)是小型热带硬骨淡水鱼，具有繁殖能力强、性成熟周期短、胚胎透明、个体小、易于养殖等优点。近年来，斑马鱼作为实验模式生物，已被广泛运用于环境毒理学、发育生物学等研究领域[1,2]。

在开展斑马鱼研究工作中, 高质量的组织病理学检查是必不可少的一项实验技术, 包括斑马鱼胚胎以及成鱼心脏、肝脏、脾脏、肾脏和性腺(包括精巢和卵巢)等内脏组织的病理切片及染色观察[3-10]。在斑马鱼研究的经典技术用书《The Zebrafish Book》[11]中，主要描述了幼鱼和胚胎的组织学实验方法，对斑马鱼成鱼的组织病理切片实验方法并未进行详细阐述。由于斑马鱼的脏器非常小，结构性质也与常用哺乳类动物有区别，因此在病理学检查实践中经常出现切片和染色效果差的情况，无法满足研究需求。

本研究在现有斑马鱼组织切片染色方法的基础上[12,13]，进行了条件摸索和优化，旨在探索一种较为理想的斑马鱼成鱼内脏组织病理学实验方法，为开展斑马鱼研究工作的同行提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

成年野生型(AB系)斑马鱼购自国际斑马鱼研究中心(俄勒冈州立大学)，体长3～4 cm，分别选取雌雄斑马鱼各5条。

1.2 试剂与仪器

Dietrich’s固定液[11](实验室配制, 配方: 体积分数100%乙醇300 mL, 冰醋酸20 mL, 甲醛100 mL，蒸馏水580 mL, 混匀封口); 二甲苯(国药集团化学试剂有限公司); 无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司); 体积分数95%乙醇(上海实验试剂有限公司); 体积分数75%乙醇(上海实验试剂有限公司); Harris苏木素染色液(德国Carl Roth GmbH Co. KG); 伊红(国药集团化学试剂有限公司); 中性树胶(国药集团化学试剂有限公司); Leica RM2235石蜡切片机(德国莱卡公司); Olympus BX43型生物显微镜(日本奥林巴斯株式会社)，Leica DFC425彩色数码摄像机(德国莱卡公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 切片标本制作方法斑马鱼在Dietrich’s固定液固定72 h，如图1横切分成头段、胸腹段和臀段，取胸腹段自来水冲洗30 min 后，将斑马鱼鱼皮剥除，进行脱水、透明和浸蜡，具体步骤: 体积分数75%乙醇30 min; 体积分数85%乙醇30 min;体积分数95%乙醇30 min; 100%乙醇(Ⅰ)30 min;100%乙醇(Ⅱ)30 min; 100%乙醇: 二甲苯(1∶1)10 min; 二甲苯(Ⅰ)至组织半透明; 二甲苯(Ⅱ)组织全透明; 二甲苯: 石蜡(1∶1) 10 min; 石蜡(Ⅰ)60 min;石蜡(Ⅱ)60 min; 石蜡(Ⅲ) 60 min, 斑马鱼一侧胸腹段平行于蜡模底部包埋, 蜡块凝固后，沿斑马鱼体轴纵向连续切片，切至内脏部分开始用载玻片收集组织切片, 直至背侧中线脊椎处，切片厚度为5 μm。

图 1 斑马鱼分段切开示意图

1.3.2 连续切片HE染色步骤 切片烘干后，进行脱蜡，水化，染色，脱水，透明，封片。具体步骤为: 二甲苯(Ⅰ)10 min，二甲苯(Ⅱ)10 min，二甲苯(Ⅲ) 10 min, 体积分数100%乙醇(Ⅰ)3 min，体积分数100%乙醇(Ⅱ) 3 min，体积分数95%乙醇 2 min，体积分数85%乙醇2 min，体积分数75%乙醇2 min，双蒸水1 min，Harris苏木素染色液1.5 min，温水冲洗7 min，双蒸水1 min，体积分数95%乙醇1 min, 伊红染色液1 min, 体积分数75%乙醇30 s，体积分数85%乙醇1 min，体积分数95%乙醇 (Ⅰ) 2 min，体积分数95%乙醇(Ⅱ)2 min，体积分数100%乙醇(Ⅰ) 3 min，体积分数100%乙醇(Ⅱ)3 min，二甲苯(Ⅰ)2 min，二甲苯(Ⅱ) 2 min，二甲苯(Ⅲ) 2 min，中性树胶封片，显微镜下观察并拍照。

1.3.3 标本制作方法改进 经过反复的条件摸索和优化，确定了四点改进方法。首先，胸腹段脱水前先将固定后的斑马鱼鱼皮剥除，这一步骤对观察后面的透明过程非常重要; 其次，沿斑马鱼体轴纵向连续切片，直至背侧中线脊椎处，切至内脏部分开始用载玻片收集组织切片; 再次，根据剥皮后斑马鱼二甲苯透明程度，摸索最佳脱水时间，梯度乙醇脱水时间优化为30 min; 最后，HE染色后用温水冲洗切片进行颜色反蓝。

2 结果

采用优化的方法制作斑马鱼成鱼内脏组织连续切片和染色，显微镜下分别观察心脏、肝脏、脾脏、胆囊、肾脏、胰腺、消化道及雌雄斑马鱼性腺(精巢和卵巢)，结果见图2。图2J为部分斑马鱼鳃没有全部切除，组织切片染色的结果。

从图中可以可到斑马鱼组织均切片完整，无折叠或裂开，组织细胞核蓝染，细胞质红染区分明显，不同内脏组织解剖学和细胞学特点清晰，没有出现组织脆裂或收缩。

3 讨论

与哺乳类动物相比，斑马鱼体积较小，内脏脏器非常集中，主要在胸腹段，包括心脏、肝脏、脾脏、肾脏、消化道及性腺等组织和器官，有研究者采用固定前取出各内脏脏器和组织进行固定、包埋和切片[10,13]，但因为斑马鱼内脏脏器比较小，新鲜取材时容易对组织造成物理损伤，切片的组织学形态也会改变。本实验采用整鱼固定后连续切片，可最大程度保持斑马鱼内脏各脏器的组织形态，包埋切片后，染色显示各脏器细胞学特点明显，结合解剖学大致定位，有利于对各脏器组织进行病理学研究。斑马鱼内脏组织病理学研究必须依据清晰高质量的脏器组织染色切片，因此，成功的连续切片标本制作是关键，包括固定、脱水、透明、包埋、切片和染色。若脱水不充分，无法进行后面的透明和浸蜡; 二甲苯没有完全置换乙醇，组织内也不能充满石蜡，都不能顺利切片。相反，乙醇处理时间太长，容易引起组织收缩; 二甲苯透明处理时间过长，则会引起组织脆裂, 因此,每个步骤都需要反复摸索和优化。

图 2 斑马鱼内脏器官组织学观察

斑马鱼固定时保证鱼体的平展, 避免弯曲, 为保证内脏器官完整，进行分段时垂直于体轴，分别在鳃盖后方和臀鳍前平泄殖孔处横切，将斑马鱼分为头段、胸腹段和臀段，取胸腹段制作连续切片标本，可以观察到完整的内脏器官。鳃作为斑马鱼的呼吸器官，可通过观察病理组织变化评价其呼吸机能[10,14], 本实验显示部分鳃没有完全切除的斑马鱼，通过本方法得到的斑马鱼鳃组织切片无折叠或裂开，所以评价目的器官为斑马鱼鳃时，可以考虑分段时在鳃盖前方横切，后续采用本方法包埋切片, 染色后也可以清晰观察斑马鱼鳃组织学变化。

因为斑马鱼体侧具有像斑马一样的暗蓝与银色相间的条纹，本研究预实验表明二甲苯透明过程因鱼皮反射光线，不能观察透明程度，因此考虑将鱼皮剥除。首先尝试了新鲜斑马鱼剥皮，但难度大，并且具有牵拉过程伤及内脏，因此改为固定后对斑马鱼进行剥皮，比较容易完成，而且有利于保持内脏组织形态。

固定后斑马鱼进行脱水，根据剥皮后斑马鱼二甲苯透明程度，摸索最佳脱水时间，本实验设计梯度乙醇脱水时间分别设为：10 min、30 min、45 min，结果显示脱水30 min和45 min组织透明均较为理想，考虑节约时间，梯度乙醇脱水时间优化为30 min。

HE染色过程也要注意: 首先，染色前将苏木素染色液过滤，二甲苯和梯度乙醇保持新鲜; 其次，苏木素染色后，用温水(40 ℃左右)冲洗切片进行颜色反蓝。通过优化制作方法，制作出的斑马鱼连续切片标本，各脏器组织染色效果好，可以清晰观察各组织结构和细胞学特点。

综上所述，本研究通过反复摸索，优化了斑马鱼成鱼内脏组织病理学标本制作和染色方法，效果较为理想。针对已有斑马鱼成年连续切片方法文献在操作细节上进行进一步细化和完善，补充并丰富了不同组织脏器的HE染色图片[12]。

本研究为获得高质量的斑马鱼内脏组织病理学标本提供了一种方法，希望能为开展斑马鱼研究工作的同行们提供技术参考。

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Optimization on Methodology of Histopathological Examination in Adult Zebrafish Visceral Tissues

TIAN Fang1, WANG Yu-zhu1, XIA Min-jie1, SUN Bing1,DING Xun-cheng1, LI Wei-hua1, XU Hui-hui2, HU Jing-ying1
(1. State Key Labs of Family Planning Devices, Shanghai Institute of Planned Parenthood Research, Shanghai 200032, China; 2. Shanghai Municipal Center For Disease Control & Prevention, Shanghai 200336, China)

ObjectiveTo explore the optimized method of paraffin serial section and hematoxylineosin (HE) staining of the adult zebrafish visceral tissues.MethodsAfter the zebrafish was fixed, the tissues were segmented, and the thoracic/abdominal segment which contains internal organs was stripped of skin and dehydrated by gradient ethanol (dehydration time was optimized to 30 min), transparented by xylene and embedded by paraffin. The tissue was sectioned serially along the body axis, rinsed with warm water after HE staining, and observed under microscope.ResultsThe microscopic observation of heart, liver, spleen, gallbladder, kidney, pancreas, gastrointestinal tract, testis and ovary showed that effects of tissue sectioning and staining were favorable. The sections were intact without collapse or fracture, the anatomical and cytological structure of all organs were clear and complete, the nucleus were neatly blue-stained and the cytoplasm were neatly red-stained.ConclusionWith the optimized histopathological method, we were able to obtain high quality histological specimens of the internal organs of adult zebrafish.

Zebrafish; Visceral tissue; Serial section; Hematoxylin-eosin (HE) staining

R332 Q95-33

A

1674-5817(2017)06-0465-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.06.008

2017-05-10

上海市科委实验动物研究专项(15140901200); 上海市第四轮公共卫生三年行动计划重点学科建设计划—环境卫生学与劳动卫生学(15GWZK0201);上海市青年科技英才扬帆计划(15YF1410000)

田 芳(1985-), 女, 硕士, 助理研究员, 生殖毒理学方向。E-mail: 376616808@qq.com

胡晶莹, 女, 博士, 助理研究员, 生殖毒理方向。

E-mail: hujingying@aliyun.com;

许慧慧, 女, 硕士, 主任医师, 环境卫生方向。E-mail: xuhuihui@scdc.sh.cn.