不同超排卵方案对BALB/c小鼠超排卵效果的影响

顾剑洁, 葛 蓉, 徐伟超, 刘丽均

(1. 上海交通大学农业与生物学院, 上海200240;2. 上海斯莱克实验动物有限责任公司, 上海 201615;3. 南京农业大学动物医学院，南京 210095)

不同超排卵方案对BALB/c小鼠超排卵效果的影响

顾剑洁1,2, 葛 蓉2, 徐伟超3, 刘丽均2

(1. 上海交通大学农业与生物学院, 上海200240;2. 上海斯莱克实验动物有限责任公司, 上海 201615;3. 南京农业大学动物医学院，南京 210095)

目的研究不同剂量及注射时间的促黄体素释放激素(LHRH-A2)、孕马血清促性腺激素(PMSG)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、抑制素抗血清(IAS)对小鼠超排卵效果的影响。方法以BALB/c近交系小鼠为实验对象，160只雌性小鼠随机分为4组，每组40只，按照注射剂量不同分为4组，A组: 腹腔注射5 IU LHRH-A2，间隔72 h后注射10 IU PMSG，间隔48 h后注射10 IU hCG; B组: 腹腔注射5 IU LHRH-A2，间隔48 h后注射10 IU PMSG，间隔48 h后注射10 IU hCG;C组: 腹腔注射10 IU PMSG, 间隔48 h后注射10 IU hCG; D组: 腹腔注射0.2 mL IAS, 间隔48 h后注射10 IU hCG。次日早取卵、体外受精(IVF)培养, 统计排出卵母细胞的数量, IVF率(IVF%)和异常率。结果D组平均超数排卵数高于另外3组(P＜0.05), 但同时IVF率低于另外3组(P＜0.05)。A 、B、C组平均超数排卵数，IVF率, 异常率均无统计学差异(P＞0.05)。结论对于BALB/c小鼠,采用IAS和hCG超排激素组合, 得到的卵子数目比另外3组显著增多, 但2-细胞期胚胎数少。采用LHRH-A2、PMSGT和hCG超排激素组合, 得到的2-细胞期胚胎数比另外3组更多, 异常卵数少。

BALB/c小鼠; 抑制素抗血清(IAS); 促黄体素释放激素(LHRH-A2)

小鼠是现代生物医学中应用最为广泛的实验动物，随着基因工程技术(如基因导入、基因置换及基因剔除)的发展，对小鼠胚胎的需求量逐渐增多。另外，一些特殊疾病动物模型的资源保存和品系培育，也需要大量的胚胎进行冷冻保藏。依靠小鼠的自然排卵，得到的胚胎数较少而且耗时耗力耗财[1]。用外源激素处理雌性小鼠，改变其性周期，使之按照预定时间超数量地排卵，从而在短时间内可以获得大量的胚胎以满足工作的需要，称为超排卵(简称超排)[2]。用激素处理动物进行超数排卵是进行胚胎移植、基因修饰、克隆等研究的基础技术之一，通过超数排卵获得大量一致的、优质的卵子或受精卵是胚胎移植的关键技术之一，这种方法在现代生物医学研究中具有重要的意义。

黄体激素释放激素(LHRH)是与生殖功能密切相关的由10个氨基酸组成的多肽，由于它能刺激垂体前叶释放促性腺激素，故又称为促性腺激素(GnRH)[3]。天然的LHRH是由丘脑下部弓状核合成，作用于脑垂体促性腺细胞，能促使动物垂体前叶释放促黄体素(LH)和促卵泡素(FSH)合成与分泌，调控受体激素水平及生殖功能，调节LH和FSH的合成与分泌。1971年LHRH的结构被确定并合成，1972年以来，人工合成的LHRH上千种，近30年来，LHRH及其他类似物在动物生殖系统促进繁殖等方面广为应用。

C57BL/6背景小鼠是在2002年完成的第一个基因组测序的小鼠品系，广泛应用于建立转基因小鼠模型[4]。对于C57BL/6背景小鼠超排的最适合的激素剂量，国内外已做过很多相关实验，目前，常规剂量国外多采用PMSG与hCG各5 IU或各7.5 IU剂量[5]，国内采用PMSG与hCG各5 IU或各10 IU剂量的方法，间隔时间为48～52 h[6]。2015年日本熊本大学实验室通过结合使用抑制素抗血清(IAS)与马绒毛膜促性腺激素(eCG), 相对PMSG与hCG的方法，C57BL/6J小鼠超排卵子数目提高了3倍[7]。

但对于BALB/c，使用IAS与hCG是否有同等效果，目前还未可知。另外，在常规激素组合PMSG和hCG中，尝试添加LHRH，是否能提高小鼠超排卵子数目。

本试验在雌鼠的年龄与体质量、外源激素等因素不变的条件下，以BALB/c小鼠为试验材料，实验探索外源激素LHRH，PMSG，hCG，IAS不同剂量组合对白化小鼠超排的最佳剂量组合，为今后的相关研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级BALB/c小鼠(雌鼠8周龄左右, 雄鼠10周龄以上)由上海斯莱克实验动物有限公司[SCXK(沪)2012-0002]提供; 饲养于清洁级动物室内[SYXK(沪)2012-0002], 自由采食和饮水, 室温(22±2) ℃, 光照12 h/d，8∶00～20∶00，调节生理周期，使其适应环境。

1.2 实验器械

超净工作台, CO2恒温培养箱, 体视显微镜, 实体倒置显微镜, 维纳斯剪, 捡卵针, 口吸式移卵管等。

1.3 实验试剂

促黄体素释放激素A2(LHRH-A2)(生产批号: 兽药字(2016)110252086)、PMSG(生产批号: 兽药字(2015)110254564)、hCG(生产批号: 兽药字(2016)110251281)均购自宁波第二激素厂; 人输卵管液(HTF)按QQuinn 的方法[8]配制; IAS由熊本大学实验室提供,其余试剂除特殊说明外均为美国Sigma公司产品。

1.4 实验方法

1.4.1 雌鼠的超排 选用8周龄的雌鼠40只, 雌鼠随机分为4组，每组10只，激素剂量分别为LHRHA2(5 IU)，PMSG(10 IU)，hCG(10 IU)，IAS(0.2 mL)，按照注射时间不同分别分为: A组每只小鼠腹腔注射LHRH-A2, 间隔72 h后注射PMSG，间隔48 h后注射hCG；B组每只小鼠腹腔注射LHRH-A2, 间隔48 h后注射PMSG，间隔48 h后注射hCG; C组每只小鼠腹腔注射PMSG, 间隔48 h后注射hCG;D组每只小鼠腹腔注射IAS，间隔48 h后注射hCG进行超排，实验重复4次。

1.4.2 培养皿的准备 第6日用35 mm养皿做HTF培养滴，矿物油覆盖，放入37 ℃，体积分数5%CO2培养箱平衡过夜，第7日使用。

1.4.3 精子获能 10周龄雄鼠颈椎脱臼法处死, 剖腹取附睾，用注射针刺破附睾，挤出精子团放入HTF 培养滴中，培养箱培养1.5 h获能[9]。

1.4.4 卵母细胞的收集 雌鼠脱颈处死，在超净台中取出两侧输卵管，利用体视显微镜，用眼科镊撕开输卵管膨大的壶腹部，并将卵母细胞-卵丘复合物收集到HTF液点内。

1.4.5 体外受精(IVF) 显微镜下观察培养1.5 h后的精子活力和数量，取适量的已获能的精子加入含卵母细胞的培养滴中，培养箱中过夜培养。隔日在显微镜下观察, 统计卵母细胞数、2-细胞期胚胎数、未受精卵数、异常卵数, 并计算IVF率=(2-细胞期胚胎数/卵母细胞数)×100%，异常率=(异常卵/卵母细胞数)×100%[10]。

1.5 统计学分析

数据用x-± s表示，利用SPSS19.0软件进行统计分析，采用方差分析和多重比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

对4组剂量组超排效果进行比较, D组的卵母细胞数明显高于A、B、C组(P＜0.05)。但D组的IVF率明显低于A组、B组、C组(P＜0.05)(表1)。

实验显示, 使用IAS后, 有效提高了BALB/c小鼠超排数目，但同时降低了卵母细胞的受精率。添加LHRH-A2后，卵母细胞数没有显著提高，但2-细胞期胚胎数的增加和异常卵的减少，实际上提高了IVF获得的有效胚胎数(表1)。

表 1 4组激素组合对BALB/c小鼠超排效果比较

3 讨论

在小鼠IVF-胚胎移植(ET)实验中，常用PMSG模仿内源性FSH的促进卵成熟作用， hCG模仿LH的诱导作用[11]。

超排成功与否取决于雌鼠的年龄与体质量、激素的剂量和注射时间以及小鼠的品系。根据我们实验室前期的实验结果显示, 相比C57BL/6J雌鼠超排，BALB/c雌鼠的最适日龄是大于8周龄, 这可能与白化雌性小鼠的性成熟程度有关, 8周龄小鼠已达到性成熟, 卵泡成熟周期已经开始，对FSH有反应，所以本实验中所用的小鼠统一为8周龄[12]。另外，不同品系的小鼠其受精率也不尽相同，这取决于对FSH和LH的敏感程度。尽管对于大多数小鼠品系，推荐使用PMSG和hCG剂量是腹腔注射5 IU，但因具体小鼠品系和激素生产厂家的不同而有所区别，本实验采用LHRH-A2的剂量为5 IU，PMSG和hCG的剂量为10 IU。注射激素的间隔时间，既影响卵母细胞发育的同步性，又影响获得卵母细胞的数量。

超排的最终目的是通过IVF可以获得大量早期发育的且分裂同步的优质受精卵，可以用于小鼠品系资源的保存，尤其适用于每年不断新增的遗传工程小鼠，从而节省大量人力、经费和物力的投入。在本实验中，相比PMSG与hCG的组合, 使用IAS与hCG的组合能有效提高BALB/c小鼠超排卵子数目, 但同时却又降低了卵母细胞的受精率, 2-细胞期胚胎数并没有显著增多。IAS对于BALB/c小鼠并没有达到C57BL/6J小鼠的相同效果。添加了LHRH后，虽然不能显著提高获得的卵母细胞数，但2-细胞期胚胎数的增加和异常卵的减少，实际上提高了IVF获得有效胚胎的效率，对于某些以白化小鼠为背景的转基因小鼠的有效保持，以及白化小鼠生物净化等工作提供了思路。对于LHRH注射剂量的进一步细化、LHRH注射是否能提高IVF胚胎的着床率以及仔鼠出生率，我们还在进一步研究当中。对于IAS对其他品系的白化小鼠超排的效果如何，需要进一步实验研究。

[1] 薛莲, 张守纯, 沈龙, 等. 周龄对昆明小鼠超排效果及胚胎体外发育的影响[J]. 饲料研究, 2016, 6:1-4.

[2] 徐平. 不同日龄和品系小鼠超排卵、体外受精及受孕率的比较研究[J]. 中国实验动物学杂志, 2001, 11(2):78-81.

[3] 扈正桃, 杨芳炬, 黄继华, 等. lhrh药代动力学试验[J]. 四川生理科学杂志, 2005, 27(1):9-11.

[4] 冯蕾, 吴发伟, 张振强, 等. PMSG与hCG给予剂量及时间对小鼠超排卵效果的影响[J]. 现代肿瘤医学, 2010, 18(12):2321- 2323.

[5] 曹俊伟, 赖双英, 张文广, 等. 不同剂量PMSG/hCG对小鼠超排效果及胚胎卵裂率的影响 [J]. 内蒙古农业大学学报,2010, 1:152-154.

[6] 孙玉成, 张建芳, 孟令君, 等. 影响小鼠超数排卵效果的因素[J]. 北京农学院学报, 2005, 20(4):17-19.

[7] Takeo T, Nakagata N. Superovulation using the combined administration of inhibin antiserum and equine chorionic gonadotropin increases the number of ovulated oocytes in C57BL/6 female mice[J]. PLoS One, 2015, 10(5): e0128330.

[8] Quinn P, Kerin JF, Warnes GM. Improved pregnancy rate in human in vitro fertilization with the use of a medium based on the composition of human tubal fluid[J]. Fertil Steril,1985, 44(4):493-498.

[9] 孙青原, 陈大元 (译). 小鼠胚胎操作实验手册[M]. 北京: 化学工业出版社, 2006:121-130.

[10] 徐平, 川野佳代, 刘丽均, 等. 实验大鼠、小鼠胚胎的缓慢冷冻和玻璃化冷冻的比较 [J]. 上海交通大学学报, 2002,20(4):261-265．

[11] 宋绍征, 王怡, 王宝珠, 等. 激素剂量、小鼠品系及周龄对超数排卵的影响[J]. 实验动物科学, 2011, 28(4):5-8.

[12] 徐平, 山村绫子, 唐一岷, 等. 不同品系小鼠的体外受精、胚胎冷冻及移植的比较研究 [J]. 中国实验动物学报, 2004,12(3):147- 151.

Q95-33

B

1674-5817(2017)06-0482-03

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.06.012

2017-03-31

上海市科委实验动物专项科研计划项目(14140900500, 15140900100)

顾剑洁(1984-), 女, 硕士生, 研究方向: 动物生殖工程和低温生物学。E-mail: 770980460@qq.com

刘丽均(1974-), 女, 副研究员, 研究方向: 低温生物学和生殖工程。E-mail：lijunliu2005@163.com