含糖量对山葡萄酒苹果酸-乳酸发酵的影响

张宇录，高鹏飞，于纪洋，丁玉萍*，刘 悦，夏志瑶

（1.佳木斯大学 生命科学学院，黑龙江 佳木斯 154007；2.东北农业大学 生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

含糖量对山葡萄酒苹果酸-乳酸发酵的影响

张宇录1，高鹏飞1，于纪洋2，丁玉萍1*，刘 悦1，夏志瑶1

（1.佳木斯大学 生命科学学院，黑龙江 佳木斯 154007；2.东北农业大学 生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

以东北高寒地区产的山葡萄酿造的山葡萄酒为研究对象，探究山葡萄酒苹果酸-乳酸发酵过程中含糖量对其pH值、总酸、苹果酸-乳酸转化程度、总糖的影响。山葡萄酒中的葡萄糖含量对其pH值的升高、总酸的降低及苹果酸乳酸转化程度均有影响。在4个梯度葡萄糖含量的山葡萄酒中，含糖量为10.67 g/L的山葡萄酒其pH升高值（0.18）、总酸度降低值（6.05 g/L）最大，苹果酸乳酸转化程度最高。

山葡萄酒；含糖量；苹果酸-乳酸发酵

山葡萄是我国东北地区的主要酿酒葡萄品种，其含水量较低，干物质较多，但总酸含量较高[1-2]。山葡萄经发酵后酿出的山葡萄酒干浸出物高，口感醇厚，果香浓郁，色泽艳丽[3-5]；但其较高的总酸使山葡萄酒品尝起来比较酸涩，适口性差[8-10]。本试验含糖量设置的四个梯度分别代表干型、半干型、半甜型和甜型四种类型的山葡萄酒，探究含糖量对山葡萄酒苹果酸-乳酸发酵的影响。

苹果酸-乳酸发酵（malolactic fementation，MLF）是葡萄经主发酵后，在后发酵过程中乳酸菌将苹果酸转化为乳酸和二氧化碳的过程[12]，属于生物降酸。采取MLF的目的是降酸，改变葡萄酒香气构成，提高产品稳定性及品质[13]。MLF不同于化学降酸和物理降酸。MLF分解的是葡萄酒中口感酸涩生⒉的苹果酸，生成口味柔和的乳酸[14-16]。二元酸在转化为一元酸的过程中，葡萄酒的酸度降低，口感变得柔和，乳香特征凸显，颜色也发生改变[17]。MLF是高档干红葡萄酒必要的二次发酵工艺，一部分厚重型干白葡萄酒也采取该工艺[18-19]。

目前，关于含糖量与苹果酸-乳酸发酵关系以及影响方面研究国内外报导尚少。本试验通过研究含糖量对苹果酸-乳酸发酵的影响，探究山葡萄酒发酵过程中最适的含糖量，从而使山葡萄酒口感圆润、醇厚、酸涩感降低。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 山葡萄酒及菌株

佳木斯大学生命科学学院发酵工程实验室保存的自酿山葡萄酒（pH 2.92±0.05，总酸度13.16g/L，酒精度12.5%vol，还原糖含量为4.67 g/L）。

乳酸菌Lactoenos450PreAC：购买于烟台帝伯仕自酿机有限公司；葡萄糖（食品级）：广州恩轩朗邦化工产品有限公司；葡萄酒专用活性干酵母：宜昌安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 试剂

酵母膏、牛肉膏、胰蛋白胨、葡萄糖、硫酸镁、苹果酸钠、柠檬酸三铵、碳酸钾（均为食品级）、吐温-80、苹果酸、乳酸、正丁醇、冰乙酸、溴酚蓝（均为分析纯）：北京奥博星生物技术有限责任公司

1.1.3 活化培养基

山葡萄汁200 mL、酵母膏5 g、牛肉膏10 g、葡萄糖30 g、硫酸镁0.56 g、苹果酸钠20 g、吐温-80 1 g、胰蛋白胨15 g、柠檬酸三铵2 g，依次溶解，混合均匀，蒸馏水定容至1 L，调pH至4.6，121℃灭菌20 min。

1.1.4 纸层析液

展开剂：正丁醇∶冰乙酸∶蒸馏水为2∶1∶1。 显色剂：1 L展开剂中加入0.6 g溴酚蓝。将试剂混合均匀后，倒入试剂瓶中，密封储存备用[14]。

1.2 仪器与设备

YXQ-LS-75SII高压蒸汽灭菌锅：上海博讯事业有限公司医疗设备厂；150G恒温振荡培养箱：江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；TDZ4-WS低速台式离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司；CJ-78-1A磁力加热搅拌器：上海跃进医疗器械厂；PHS-3C型精密酸度计：杭州雷磁分析仪器公司。1.3方法

1.3.1 样品处理方法

1.3.2 菌种活化与接种

（1）菌种活化：将保存的菌种按10%的接种量接种到活化培养基中，于25℃恒温箱培养96 h，取出备用。

（2）接种：按10%的接种量接种活化后的菌悬液于离心管中，4000r/min离心10min，弃去上清液，然后加无菌水洗涤，于4 000 r/min离心10 min，弃去上清液，重复洗涤3次。用待接种酒液将酒类酒球菌沉淀稀释后接入发酵瓶中。

1.3.3 试验设计

表1 试验山葡萄酒酒样参数Table 1 Parameters of tested wild grape wine samples

取5个500 mL试剂瓶，分别编号为0、1、2、3和4号，每瓶装干红山葡萄酒400 mL，按照表1分别加入葡萄糖，原酒不接种，其余四组按“1.3.2（2）”接种方法接入乳酸菌，混合均匀，然后分装于10 mL带盖的试管中，置于室温（20～22℃）条件下避光培养。每隔3 d对其pH值和总酸度进行测量，每隔5 d对其含糖量和苹果酸乳酸转化程度进行测量。每个指标取三支试管的酒样进行测量，结果取平均值。

1.3.4 检测方法

pH值的检测：采用精密酸度计测定；总酸度的检测：采用酸碱滴定的方法测定[4]；苹果酸-乳酸转化量的检测：采用纸层析法测定[5]；总糖的检测：采用3,5-二硝基水杨酸法测定[7]。

2 结果与分析

2.1 含糖量对山葡萄酒苹果酸-乳酸发酵过程中pH值的影响

测不同含糖量山葡萄酒在苹果酸-乳酸发酵过程中pH值，结果如图1所示。

图1 含糖量对山葡萄酒苹果酸-乳酸发酵过程中pH值的影响Fig.1 Effect of sugar content on wild grape wine pH in the process of malolactic fermentation

由图1可知，4组山葡萄酒在MLF过程中pH值的总体变化规律均是先升高后降低，4组葡萄酒从第1天到第3天pH值升高的速度较快，从第3天开始缓慢升高，到第24天达到最大值，各组pH升高值为2组（0.18）＞1组（0.15）＞3组（0.14）＞4组（0.11）＞原酒（0.07），此后，随着发酵的进行，4组葡萄酒的pH值均开始下降。故含糖量约为10.67 g/L时，pH值升高最大，含糖量过高、过低都不利于山葡萄酒MLF过程中pH值的升高；发酵时间也不宜过长，应在20 d左右，否则，会使pH值再下降。

2.2 含糖量对山葡萄酒MLF过程中总酸度的影响

测不同含糖量山葡萄酒在苹果酸-乳酸发酵过程中的总酸度，结果如图2所示。

由图2可知，不同含糖量的山葡萄酒在MLF过程中总酸度变化趋势均为缓慢降低。总酸度在MLF过程中下降值由高到低依次为2组（6.05 g/L）＞1组（5.86 g/L）＞3组（5.18 g/L）＞4组（4.30 g/L）＞原酒（0.32 g/L），2号山葡萄酒的总酸度降低的最多，4号山葡萄酒的总酸度降低的最少，两者的总酸度相差1.75 g/L。故含糖量对山葡萄酒在MLF过程中总酸度降低有影响，总酸降低值与苹果酸-乳酸转化程度有关，与含糖量也有关系。含糖量过高，影响MLF过程中酸度下降，含糖量为10.67 g/L时，山葡萄酒的总酸度降低的最多。

图2 含糖量对山葡萄酒苹果酸-乳酸发酵过程中总酸度的影响Fig．2 Effect of sugar content on total acidity of wild grape wine in the process of malolactic fermentation

2.3 含糖量对山葡萄酒MLF过程中苹果酸-乳酸转化的影响

不同含糖量山葡萄酒苹果酸-乳酸发酵1 d、10 d和20 d苹果酸-乳酸转化纸层析结果如图3所示。

图3 发酵第1天（a）、第10天（b）和第20天（c）苹果酸-乳酸转化纸层析图Fig．3 Malolactic conversion chromatogram of the 1 d （a），10 d （b）and 20 d （c）of fermentation

由图3a可知，山葡萄酒苹果酸-乳酸发酵第1天，不同含糖量的4个酒样均未出现乳酸斑点，苹果酸斑点均很清晰明显，说明苹果酸含量较多，没有转化乳酸。

由图3b可知，酒苹果酸-乳酸发酵第10天，不同含糖量的4个酒样均有乳酸斑点出现，每个样的乳酸斑点和苹果酸斑点大小、清晰度一样；比较4个酒样，2号酒样的苹果酸斑点较1号、3号、4号酒样苹果酸斑点小，说明2号酒样酒苹果酸-乳酸转化的量较其他3个酒样多。

由图3c可知，酒苹果酸-乳酸发酵第20天，不同含糖量的4个酒样的乳酸斑点比苹果酸斑点大，乳酸斑点比苹果酸斑点更清晰；比较4个酒样，2号酒样的苹果酸斑点较1号、3号、4号酒样苹果酸斑点明显小且淡，即2号酒样苹果酸-乳酸转化最多；还可看出3号、4号含糖量多的两个酒样的苹果酸斑点、乳酸斑点均较1号、2号含糖量少的两个酒样大，即3号、4号酒样的苹果酸、乳酸含量较1号、2号均多，说明含糖量高一方面抑制苹果酸-乳酸转化，另一方面，一部分糖发酵生成了乳酸。

综上，含糖量过高或过低均不利于苹果酸-乳酸发酵，不利于山葡萄酒的降酸。即含糖量为10.67 g/L时，苹果酸-乳酸转化程度最好。

2.4 含糖量对山葡萄酒苹果酸-乳酸发酵过程中总糖的影响

含糖量对山葡萄酒苹-乳发酵过程中总糖的影响见图4。由图4可知，1号、2号、3号和4号山葡萄酒在苹果酸-乳酸发酵过程中总糖的变化趋势均为下降。1号总糖降低了0.18g/L，下降了3.85%；2号总糖降低了0.34 g/L，下降了3.19%，3号总糖降低了2.35 g/L，下降了9.52%，4号总糖降低了6.13 g/L，下降了11.21%，原酒总糖降低了0.06 g/L，下降了1.28%。

图4 含糖量对山葡萄酒苹果酸-乳酸发酵过程中总糖含量的影响Fig．4 Effect of sugar content on total sugar contents of wild grape wine in the process of malolactic fermentation

从山葡萄酒苹果酸-乳酸过程中总糖降低百分率来看，2号最低、4号最高，由高到低依次为4号＞3号＞1号＞2号，1号和2号总糖降低百分率值比较接近。可见，山葡萄酒的含糖量越多，其在苹果酸乳酸发酵过程中总糖下降百分率越大，但对酒的风味无不良影响。

3 结论

通过含糖量对山葡萄酒苹果酸-乳酸发酵影响的研究发现，山葡萄酒的含糖量对苹果酸-乳酸发酵影响较大。本研究含糖量设置的四个梯度分别代表干型、半干型、半甜型和甜型四种类型的山葡萄酒，含糖量为10.67 g/L的山葡萄酒（即半干型）苹果酸-乳酸发酵pH升高值、总酸度降低值最大，苹果酸-乳酸转化程度最好。

山葡萄酒中含糖量过低的干型山葡萄酒，由于糖分营养不足，会影响MLF菌的生长、繁殖和代谢，从而影响苹果酸-乳酸转化。

山葡萄酒中含糖量高和过高的半甜型和甜型山葡萄酒，由于糖分过剩，阻遏苹果酸-乳酸酶的合成，影响苹果酸-乳酸转化；但苹果酸-乳酸发酵过程中其乳酸含量并不比半干型山葡萄酒少，说明过剩的糖通过乳酸代谢生成了乳酸，所以会影响pH值的升高和总酸的降低。

为了使山葡萄酒更好地进行苹果酸-乳酸发酵，应控制好主发酵的时间，即严格控制苹果酸-乳酸发酵菌的接种时间，使主发酵结束时含糖量为适量（10 g/L左右），否则会影响苹果酸-乳酸发酵的启动及苹果酸-乳酸转化程度。

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Effect of sugar content on malolactic fermentation of wild grape wine

ZHANG Yulu1,GAO Pengfei1,YU Jiyang2,DING Yuping1*,LIU Yue1,XIA Zhiyao1
（1.College of Life Science,Jiamusi University,Jiamusi 154007,China;2.College of Life Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China）

Using the wild grape wine which was made of wild grape in the cold area of northeast as research object,the effect of sugar content on pH,total acid,malolactic conversion extent and total sugar content during malolactic fermentation process was investigated.The glucose content in wild grape wine would affect the pH increasing,total acid content decreasing and malolactic conversion extent.For the contents of glucose in wild grape wine,when the glucose content was 10.67 g/L,the pH value increased the most（0.18）,the total acid decreased the most（6.05 g/L）,and the malolactic conversion rate was the highest.

wild grape wine;glucose content;malolactic fermentation

TS261.4

0254-5071（2017）12-0101-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.021

2017-07-12

黑龙江省教育厅自然科学基金项目（2016-KYYWF-0612）；佳木斯大学校长创新创业基金项目（xzyf2016-29）；佳木斯大学研究生科技创新项目（YZ2016_009）

张宇录（1995-），女，本科生，研究方向为微生物发酵及生物技术在食品方面的应用。

*通讯作者：丁玉萍（1964-），女，高级工程师，本科，研究方向为微生物发酵及生物技术在食品方面的应用。