河南省3株马立克病病毒Meq基因的序列分析

张天伟，章剑君，何宏轩

(1.宛西中等专业学校，河南南阳 474350；2.社旗县教师进修学校，河南南阳 473300；3.中国科学院动物研究所，北京 100101)

河南省3株马立克病病毒Meq基因的序列分析

张天伟1△，章剑君2△，何宏轩3*

(1.宛西中等专业学校，河南南阳 474350；2.社旗县教师进修学校，河南南阳 473300；3.中国科学院动物研究所，北京 100101)

根据GenBank收录的马立克病病毒(MDV)基因组序列的Meq基因设计1对特异性引物，用PCR方法从河南发病鸡群中检测出了3株MDV，将目的片段克隆，并进行测序，获得Meq基因全长序列，将3株MDV的Meq基因与GenBank上收录的不同类型毒株进行比较分析。3株MDV的Meq基因段长度均为1 020 bp，核苷酸序列分析表明，河南株Meq基因与其他MDV核苷酸同源性为98.6%，氨基酸同源性为96.5%；Meq基因的氨基酸序列共有9个位点的氨基酸存在突变；遗传进化分析表明这些毒株有3个分支，其中Henan 1～3株、ZC2014株(KP144356.1)、YLO40920株(DQ174459.1)、HNXZ106株(HF546099.1)和vv+MDV毒株648A(AY362725.1)位于同一个分支，vMDV GA(AF147806.1)、vvMDV RBIB(AY243332.1)位于同一个分支，mMDV CVI988(AF493555.1)和中国疫苗株814(AF493551)位于同一个分支。

马立克病病毒；聚合酶链反应；Meq基因；序列分析

鸡马立克病(Marek's disease，MD)是由鸡马立克病病毒(Marek's disease virus，MDV)引起的肿瘤性传染病，典型特征为淋巴组织增生，传染性很强，鸡是主要的发病宿主，其他禽类较少发生[1]。MDV分为3个血清型，即血清1型(MDV-1)，血清2型(MDV-2)和血清3型(MDV-3)，其中只有MDV-1具有致瘤性或致病力[1-2]。MDV-1是MDV群的原型病毒，包括对宿主具有毒力或致瘤性的强毒分离株及其致弱变异株；MDV-2是从鸡分离的病毒，无致病性；MDV-3是从火鸡分离的病毒，无致病性，常用于制备疫苗[3-4]。根据毒力的强弱，可将MDV-1分为温和毒株(mild MDV，mMDV)、强毒MDV(virulent MDV，vMDV)、超强毒MDV(very virulent MDV，vvMDV)以及特超强毒MDV(very virulent plus MDV，vv+MDV)[1]。Meq基因是MDV-1毒株特有的基因，为MDV的致瘤基因，其N末端具有亮氨酸拉链结构，C末端具有富含脯氨酸重复区的转录激活域[5-9]。MD的预防与控制当前仍需通过疫苗免疫来进行[9]。近年来中国养禽业的规模不断扩大，禽类贸易大幅上升，同时MDV对常规疫苗的抵抗力也在逐渐增加，新出现的毒力增强的毒株能突破传统MD疫苗的免疫保护，因此，在疫苗免疫鸡群中常发生野毒株的感染，且致病力也呈逐渐增强趋势，MD还可导致病鸡的免疫抑制，病鸡免疫力降低，引起继发感染，对我国养禽业造成严重危害，威胁人类食品安全[9-11]。

2016年-2017年，河南省部分养鸡场疫苗免疫鸡群发生MD的流行，本研究对病鸡进行了临床诊断和病原检测，并对3个MDV毒株的Meq基因进行测序，将其与8株MDV-1参考毒株进行了比较分析，旨在了解这些分离株的遗传变异特征及可能的致病性。

1 材料与方法

1.2 材料

1.1.1 病料、鸡胚 3只鸡的肿瘤组织病料由宛西中等专业学校2016年-2017年从河南省3个规模化鸡场采集并保存；SPF鸡胚购自第四军医大学实验动物中心。

1.1.2 主要试剂 病毒基因组DNA提取试剂盒Viral DNA Kit、2×EsTaqMasterMix、 DNA Marker DL 2 000购自北京康为世纪生物科技有限公司；核酸胶回收试剂盒、pEASY-T1克隆载体、感受态细胞Trans5α、质粒提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据GenBank中收录的MDV GA株(Genbank：AF147806.1)的全基因序列，利用Primer 5.0 设计特异性引物，上游引物PF:5′-AGAGATGTCTCAGGAGCCAGAG-3′；下游引物PR:5′-TCATCAGGGTCTCCCGTCACCT-3′，扩增长度为1 027 bp，该目的片段包括了Meq基因全长1 020 bp，引物由Invitrogen公司合成后，稀释为20 μmol/L，置-20℃保存备用。

1.2.2 病毒基因组DNA提取 将病鸡的肝脏研磨，冻融3次，取200 μL研磨上清液，采用DNA提取试剂盒Viral DNA Kit提取病毒DNA。SPF鸡胚采取同样操作提取DNA，作为阴性对照。

1.2.3 PCR检测MDV及目的片段的克隆、测序 以提取的DNA为模板，30 μL PCR反应体系：2×EsTaqMastermix 15 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板2 μL，ddH2O 12 μL；反应条件为：94℃ 4 min；94 ℃ 45 s，57℃ 30 s，72 ℃ 1min，25个循环；最后72 ℃再延伸10 min。取5 μL PCR扩增产物于10 g/L琼脂糖凝胶电泳，观察结果。将电泳检测为阳性的目的条带用EasyPure Quick Gel Extraction Kit回收纯化后克隆入pEASY-T1载体，再转化大肠埃希菌Trans5α。菌落经PCR和双酶切鉴定为阳性后，摇菌，提取质粒，送华大基因公司测序。

1.2.4 Meq基因序列分析 测序成功后，截取Meq基因，用DNAStar 7.1 软件的MegAlign功能对MDV河南株和参考毒株序列进行序列比对分析及遗传进化分析。

2 结果

2.1 病鸡剖检病变

病鸡内脏多器官出现肿瘤，肝脏尤为严重，肿瘤呈圆形，有的肿瘤较小，数量多(图1A)；有的肿瘤大，数量较少(图1B)。肿瘤突出于肝脏表面，灰白色，切面呈脂肪样。

2.2 PCR扩增结果

以提取的病毒DNA为模板，PCR扩增到了1 027 bp的目的片段，与预期片段大小相符(图2)。

2.3 MDV Henan株Meq基因的核苷酸序列分析

将鉴定为阳性的质粒命名为MDV Henan 1、MDV Henan 2、MDV Henan 3，成功测序后，获得Meq基因全长。从GenBank下载MDV-1 Meq基因序列，包括中国疫苗株814(AF493551)、mMDV CVI988(AF493555.1)、vMDV GA(AF147806.1)、vvMDV RBIB(AY243332.1)、vv+MDV毒株648A(AY362725.1)，国内近几年分离毒株，包括ZC2014株(KP144356.1)、YLO40920株(DQ174459.1)、HNXZ106株(HF546099.1)，与河南株进行核苷酸序列比对。结果表明，参考毒株中国疫苗株814(AF493551.1)和mMDV CVI988(AF493555.1)Meq基因核苷酸序列大小均为1 017 bp，Henan株和其余参考毒株Meq基因核苷酸序列大小均为1 020 bp。对Henan株与MDV参考毒株Meq基因的核苷酸序列进行同源性比较，发现这些MDV分离株之间或分离株与参考毒株之间的核苷酸同源性为98.6%～100%。Henan 1和Henan 3同源性为100%，它们与Henan 2同源性为99.9%。Henan株和参考毒株比较发现，其与国内近几年分离毒株ZC2014株(KP144356.1)、YLO40920株(DQ174459.1)、HNXZ106株(HF546099.1)的同源性最高(图3)。

A.肝脏肿大，布满大小不等的肿瘤结节；B.肝脏中较大的肿瘤结节

A.Hepatomegaly,and liver full of different sizes of tumor nodules; B.Larger tumors in liver

图1病鸡肝脏病变

Fig.1 Pathological lesions in the liver of the sick chicken

M.DNA标准DL 2 000；1～3.鸡；4.阴性对照(SPF鸡胚)

M.DNA Marker DL 2 000；1-3.Chickens; 4.Negative control (SPF chicken embryo)

图2 PCR检测结果

Fig.2 The results of PCR detection

2.4 MDV Henan株Meq基因的氨基酸序列分析

将MDV Henan株Meq基因推导的氨基酸序列与其他毒株的进行比较。这些MDV毒株之间的氨基酸同源性为96.5%～100%(图略)，Henan 1和Henan 3株完全相同，与Henan 2株仅有1个氨基酸的差异。如图4所示，Henan 1～3株Meq基因氨基酸序列在第77、80、88、93、115、139、176和217位氨基酸和其他毒株不同，这些位置的变化与毒株毒力的变化存在一定的关系，这样的结果施维松等在报道中的结果一致[3]。其中Henan 1～3株第93位由谷氨酰胺Q突变为精氨酸R为独有的，和其他毒株均不相同。此外Henan 2的125位氨基酸突变为精氨酸R，其他毒株均为脯氨酸P，需要特别注意。近几年国内分离的毒株80、115、176、217位氨基酸分别变为酪氨酸Y、丙氨酸A、精氨酸R、丙氨酸A。低毒力MDV具有脯氨酸重复区，高毒力MDV在脯氨酸重复区有点突变，破坏了4个连续的P(如PPPP-，PXPP)，毒力越强发生突变的次数越多[3]。本次河南株在脯氨酸重复区有2处突变(176和217位)，符合高毒力毒株的变异特征。

图3 MDV Henan株与参考毒株Meq基因核苷酸序列同源性比对

图4 MDV河南株与参考毒株Meq基因编码的氨基酸序列的比较

2.5 MDV河南株Meq基因的遗传进化分析

用MegAlign构建MDV河南株和参考毒株的Meq基因系统进化树(图5)，发现这些分离株和参考株主要组成了3个分支，其中Henan株及国内近几年分离毒株ZC2014株(KP144356.1)、YLO40920株(DQ174459.1)、HNXZ106株(HF546099.1)和vv+MDV毒株648A(AY362725.1)位于同一个分支，vMDV GA(AF147806.1)和vvMDV RBIB(AY243332.1)位于同一个分支，mMDV CVI988(AF493555.1)和中国疫苗株814(AF493551)位于同一个分支。Henan株及国内的近几年的分离毒株和vv+MDV毒株648A(AY362725.1)亲缘关系更近。

图5 Meq基因系统进化树

3 讨论

本研究所检测出的3株MDV毒株来自河南省的3个MD疫苗免疫鸡群。表明MDV能突破MDV疫苗的免疫保护，造成感染和流行。相关研究表明，Meq基因与MDV的致肿瘤性有关[3,9,12-13]。Meq基因序列比较保守，不同毒株间核苷酸和氨基酸序列的同源性很高[3,9]。Meq基因序列分析结果表明，MDV Henan 1株和Henan 3株的Meq核苷酸序列相同，它们与Henan 2相似度为99.9%，相似度很高，有可能在河南省这些鸡场流行的是同一株MDV。比较的所有毒株之间核苷酸同源性为98.6%～100%，氨基酸同源性为96.5%～100%，Henan株与近几年国内分离毒株的同源性最近。遗传进化分析结果表明，Henan株及参考的国内近几年的分离毒株和vv+MDV毒株648A(AY362725.1)亲缘关系更近，说明这次在免疫鸡群中流行的Henan株可能为强毒株。Meq基因氨基酸突变和MDV毒株毒力具有一定的关系[3]。强毒株Meq基因的ORF全长1 020 bp，编码339个氨基酸，而疫苗毒株CV1988和mMDV CVI988株的Meq基因中缺失3个碱基CAC，导致编码的氨基酸第194位一个脯氨酸P的缺失。低毒力的毒株具有脯氨酸重复区，最强毒力毒株有3处突变(153脯氨酸P突变为Q、176位脯氨酸突变为丙氨酸A和217位脯氨酸突变为丙氨酸A)，可以打断脯氨酸重复区。本试验3个毒株在第153位没有氨基酸突变，但在176、217位氨基酸分别由脯氨酸P变为精氨酸R，脯氨酸P变为丙氨酸A，打断了脯氨酸重复区序列，具有强毒株的序列特征。MDV毒株Meq基因氨基酸的这些突变可能影响Meq的转录激活且与毒株毒力的关系具有一定的规律性，这些内容还有待进一步研究。

MD疫苗作为世界上第一种有效的动物癌症疫苗，对预防MD起关键作用。虽然目前已有多种MD疫苗如SB1苗、814苗、HVT苗，但MDV对常规疫苗的抵抗力也在逐渐增加，vvMDV和vv+MDV能突破MD疫苗的免疫保护，因此在疫苗免疫鸡群中常发生野毒株的感染，造成严重危害。本研究在2016年-2017年发生MD的免疫鸡群检测出3株MDV，并对病毒的Meq基因进行序列分析，为MDV的分子生物学研究和流行病学调查提供了资料。

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SequenceAnalysisofMeqGeneofThreeMarek’sDiseaseVirusStrainsinHenanProvince

ZHANG Tian-wei1,ZHANG Jian-jun2,HE Hong-xuan3

(1.WanxiTechnicalSchool，Nanyang，Henan474350,China； 2.SheqiTeacherTrainingSchool，Nanyang，Henan474350,China； 3.InstituteofZoology,ChineseAcademyofSciences,Beijing，100101，China)

To investigate genetic variation of Marek’s disease virus(MDV) in Henan province,one pair of primers for amplifying Meq gene of MDV were designed according to nucleotide sequence in GenBank,and three isolates of MDV were detected from infected chickens by PCR.Targeted fragments were cloned and sequenced,then compared with different types of reference MDV strains published in GenBank.The results showed that Meq gene from the three MDV isolates consisted of 1 020 bp.Compared with reference strains published in GenBank,the sequences of Meq gene in different isolates were relatively conserved and the homologies of nucleotide and amino acid sequences of the isolates were more than 98.6% and more than 96.5%.The isolates displayed amino acid site mutations at 9 positions．Phylogenetic analysis showed that the isolates and strains could be separated into three groups．The Henan1-3 strains,ZC2014 (KP144356.1),YLO40920 (DQ174459.1),HNXZ106 (HF546099.1),and vv+MDV648A (AY362725.1) were clustered into one group,vMDV GA(AF147806.1),vvMDV RBIB (AY243332.1) clustered into the second group,and mMDV CVI988(AF493555.1) and Chinese vaccine 814 strains (AF493551) were clustered into the third group.

MDV; PCR; Meq gene; sequence analysis

2017-03-31

张天伟(1966-)，男，河南南阳人，本科，主要从事兽医学研究。△同等贡献作者。*

S855.3

A

1007-5038(2017)12-0073-05