辛伐他汀对大鼠肾缺血再灌注损伤后心肌Bcl-2和Bax蛋白表达的影响*

荆 娇， 马海玲， 闫文升， 张永忠， 张玉清， 焦宗伟

(石家庄医学高等专科学校， 河北 石家庄 050000)

辛伐他汀对大鼠肾缺血再灌注损伤后心肌Bcl-2和Bax蛋白表达的影响*

荆 娇△， 马海玲， 闫文升， 张永忠， 张玉清， 焦宗伟

(石家庄医学高等专科学校， 河北 石家庄 050000)

目的观察辛伐他汀对肾缺血再灌注损伤后心肌组织的影响及其机制。方法随机将36只大鼠分为假手术组、肾缺血再灌注组和辛伐他汀组，每组12只。后2组用夹闭双侧肾动脉的方法复制肾缺血再灌注损伤模型；辛伐他汀组在造模前给予辛伐他汀(20 mg·kg-1·d-1)灌胃，持续2周。用生化检查检测血清肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)、心肌组织丙二醛(MDA)含量及乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性，并用Western blot 法检测Bcl-2和Bax的表达水平。结果与假手术组比，缺血再灌注组SCr、BUN和心肌MDA含量均升高(P<0.05)，心肌LDH和CK活性增强(P<0.05)，心肌SOD活性明显下降(P<0.05);与缺血再灌注组比较, 辛伐他汀组SCr、BUN和心肌MDA的含量降低(P<0.05)，心肌LDH和CK活性明显减弱(P<0.05)，而心肌SOD活性增强(P<0.05)。与假手术组比较,心肌Bcl-2与Bax的蛋白表达水平在肾缺血再灌注组增多(P<0.05)； 与缺血组相比, Bax表达在辛伐他汀组明显降低，而Bcl-2表达增加(P<0.05)。结论辛伐他汀对肾缺血再灌注后的心肌有保护作用，保护机制可能与辛伐他汀可以消除自由基、升高Bcl-2蛋白表达和降低Bax 蛋白表达有一定关系。

辛伐他汀; 肾缺血再灌注损伤； 心肌； 丙二醛; 超氧化物歧化酶; 乳酸脱氢酶

他汀类药物是3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A，HMG-CoA)还原酶抑制剂。自1976年Endo等[1]于桔霉素提取液中发现了美伐他汀, 随后洛伐他汀等他汀类药物相继问世。他汀类药物通过对HMG-CoA还原酶的特异性抑制作用, 使 HMG-CoA 不能转变为甲羟戊酸, 从而阻断胆固醇的合成，这一作用目前在临床上广泛用于高血脂的治疗。有研究发现,普伐他汀预处理可以通过抑制细胞凋亡减轻肾缺血再灌注损伤(renal ischemia-reperfusion injury,RIRI)[2]。他汀类药物在防治心脏疾病方面也日益受到重视,也有研究指出辛伐他汀(simvastatin,Sim)可剂量依赖性地延迟因缺氧诱导的新生心肌细胞的坏死，减轻心肌初始缺血损伤和再灌注损伤，改善心功能[3]。但他汀类药物对肾缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)后心肌组织的影响却少有报道。我们就此进行了初步研究，通过建立RIRI模型，并用辛伐他汀干预，检测血清肌酐(serum creatinine，SCr)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和心肌组织丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性以及Bcl-2和Bax蛋白表达，以探讨辛伐他汀对肾缺血再灌注后心肌的作用。

材 料 和 方 法

1 实验动物

健康雄性Sprague-Dawley大鼠36只，体重160～230 g，购自河北省实验动物中心。

2 药品、试剂和仪器

辛伐他汀购自杭州上虞京新药业有限公司；SCr和BUN测定试剂盒购自北化康泰临床试剂有限公司；MDA和SOD试剂盒购自南京建成生物制品公司；抗β-actin、Bcl-2和Bax抗体购自Santa Cruz。

HW1电热恒温水温箱(北京医疗设备厂)；LXJ-Ⅱ离心机(上海医用仪器分析厂)；GPR低温低速离心机(Beckman)；EW-3000A电子天平(沈阳天平仪器厂)；分析天平(上海精密科学仪器公司)；721分光光度计(北京第三分析仪器厂)；SN-682B全自动γ记数仪(上海日环仪器厂)； DYY-Ⅲ型电泳仪(北京六一仪器厂)；酶标分析仪(Thermo)；超低温冰箱(SANYO)；凝胶分析系统(美国UVF公司)；X线摄影暗匣(上海跃进医用光学器械厂)；塑料薄膜封口机(温州市鼎力包装机械制造有限公司)；电热保温干燥箱(重庆实验设备厂)；隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医用光学器械厂)。

3 实验方法

3.1实验分组与模型建立 将大鼠在20～26 ℃实验室喂养2 d，然后用随机数字表按完全随机分组方法将动物分成假手术(sham)组、I/R组和Sim组。每组12只。分组后，Sim组给予20 mg·kg-1·d-1Sim灌胃，持续2周；sham和I/R组每天给同量的自来水灌胃。2周之后复制RIRI模型。

复制RIRI模型的动物用10%水合氯醛腹腔麻醉，行剖腹手术， 暴露双侧肾动静脉。I/R组和Sim组夹闭双侧肾动脉，45 min后去除动脉夹再恢复血流灌注，然后逐层缝合关腹；sham组开腹但不夹闭血管，其余操作相同。再灌注后24 h各组分别从腹主动脉取血4～5 mL，分离留取血清于冰箱中低温保存，留待测定SCr和BUN含量。然后摘取心脏，冰生理盐水冲净血液，取左心室前壁部分组织，制备匀浆待检测MDA含量以及LDH、CK和SOD活性，并用Western blot 法检测Bcl-2和Bax的蛋白表达水平。

3.2生化检测方法 用苦味酸不除蛋白法完成血清SCr测定，BUN含量测定采用OPA法，采用硝酸还原酶法测定NO含量，硫代巴比妥酸法测定MDA含量，黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性。 用L-P法检测LDH活性，用N-乙酰半胱氨酸法检测CK活性。各项指标检测方法严格按说明书操作。

3.3Western blot 法检测Bcl-2和Bax 的蛋白表达 制备心肌组织前除去组织血液，用滤纸吸干，准确称重。将干净、干燥的匀浆管置于冰水混合物中，将组织块放于匀浆管中，尽快剪碎组织，然后按1∶9(W/V)加入冰生理盐水，将组织匀浆。而后将匀浆移入干燥的试管中，置于4 ℃离心机中，以3 000 r/min离心10 min。取上清液储存待测。提取蛋白后灌胶上样，加样后先用恒流10 mA，再用恒压100 V电泳至溴酚蓝到凝胶底部。待电泳停止后，将凝胶转移到PVDF 膜上，转移电压为 100 V，时间120 min。然后将 PVDF 膜移至含有封闭液的平皿中，室温下摇床上摇动封闭2 h。取出 PVDF 膜，加入稀释后的 I 抗冰箱里4 ℃过夜。再用 TBST 室温下脱色摇床上洗10 min×3次，然后加入1∶1 000 稀释的辣根酶标记羊抗兔 IgG 抗体室温孵育1 h，用 TBST 室温下脱色摇床上洗 10 min×5次。将显色剂滴加于晾干的 PVDF 膜上，显色照相。最后用Quantity One软件对条带进行分析。

4 统计学处理

采用SPSS 23.0统计软件进行统计分析。定量数据以均数±标准差(mean±SD)表示，多组数据间比较采用单因素方差分析，两组数据之间比较用t检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 辛伐他汀对RIRI大鼠血尿素氮和血清肌酐含量的影响

与sham组比较，I/R组肾功能受损,肌酐和尿素氮含量均增高，差异有统计学意义(P<0.01)。与I/R组比较，Sim组肌酐和尿素氮含量均降低，差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

2 辛伐他汀对RIRI大鼠心肌组织CK、LDH和SOD活性及MDA含量的影响

表1辛伐他汀对血清肌酐和血尿素氮含量的影响

Table 1. The changes of SCr and BUN in the I/R rats with or without Sim treatment (Mean±SD.n=12)

GroupSCr(μmol/L)BUN(mmol/L)Sham56.96±2.016.84±0.51I/R141.51±3.80△△17.58±1.12△△Sim119.76±1.12**14.86±1.54**

△△P<0.01vssham group;**P<0.01vsI/R group.

I/R组的LDH和CK活性高于sham组，差异有统计学意义(P<0.01)；与I/R组比较，Sim组的LDH和CK活性降低，差异有统计学意义(P<0.01)。I/R组心肌组织的SOD活性低于sham组(P<0.01)，MDA含量则高于sham组(P<0.01)；与I/R组相比，Sim组的SOD活性升高(P<0.01)，MDA含量则减少(P<0.01)，见表2。

表2 辛伐他汀对心肌CK、LDH和SOD活性及MDA含量的影响

△△P<0.01vssham group;**P<0.01vsI/R group.

3 辛伐他汀对肾缺血再灌注后心肌Bcl-2与Bax蛋白表达的影响

Western blot法蛋白含量检测显示,与sham组比较,I/R组Bcl-2和Bax表达均显著增高(P<0.05),而Sim组Bax蛋白表达减少,Bcl-2表达增加(P<0.05)。

讨 论

RIRI涉及多种因素，如自由基损伤、白细胞和内皮细胞之间的作用、胞内钙的超载和NO等[4]。以往的研究指出[5],缺血缺氧可以引起血管内皮细胞的损伤和脂质过氧化物增多,这是引起RIRI的关键因素之一。氧化应激是机体内氧自由基生成和去除失衡，或者由于外源性氧化剂超量摄入,导致活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的积累而引起的毒性过程。在生理状态下，机体产生SOD能快速清除氧自由基等，防止氧自由基的过量积累。Laude等[6]研究报道缺血再灌注期间可以产生的大量ROS，经过血液循环到达相应的靶器官造成器官的损伤。目前, I/R损伤的研究已不仅限于发生缺血的局部组织，远端器官如肺、肾、脑和心等也常常是受累靶器官[7]。河北省医学科学院以往也采用夹闭大鼠双侧肾动、静脉45 min后恢复血流的方法，复制肾I/R损伤模型，同时观察发现脑组织MDA含量增多，SOD的活性下降，说明脑组织在此过程中也受到了影响[8]。这也说明肾缺血后对远端器官是有影响的。虽然经过循环后的ROS水平有所降低，但产生的各种损伤因子也可引起相关器官的损伤。

在调控细胞凋亡的过程中，Bcl-2蛋白起重要作用，是线粒体凋亡通路中的一种抑制凋亡的蛋白。而Bax是Bcl-2家族成员之一，是一种促凋亡蛋白。 屈朝法等[9]研究发现,急性心肌梗死后晚期再灌注可以减少梗死周边缺血区心肌细胞凋亡，其机制可能与心肌细胞表达Bax蛋白减少有关。也有报道雌激素能够保护心肌，机制可能通过降低NF-κB的表达进而上调Bcl-2 mRNA的表达、下调Bax mRNA的表达来实现逆转缺氧对心肌细胞的抑制作用[10]。孙晓靖等[11]对异丙肾上腺素损伤大鼠采用阿托伐他汀预先干预,发现对心肌在左室重塑指标方面有显著改善,其可能通过促进Bax/Bcl-2趋于平衡而对心肌细胞凋亡产生影响,早期应用阿托伐他汀可能有益于损伤心肌。这些都表明Bcl-2能抑制心肌细胞凋亡,而Bax则可促进其凋亡。

Figure 1. The protein expression of Bax (A) and Bcl-2 (B) in the rat myocardium detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsSham group;#P<0.05vsI/R group.

图1辛伐他汀对肾缺血再灌注后心肌Bcl-2与Bax蛋白表达的影响

本次实验采用河北省医学科学院的以往方法复制肾I/R损伤模型[12]，观察再灌后24 h各项指标变化。结果表明I/R组肾功能明显受损，肌酐和尿素氮高于假手术组，而辛伐他汀组肌酐和尿素氮含量低于I/R组。I/R后组织中MDA含量、LDH和CK活性增加，同时SOD活性显著降低，而给予辛伐他汀干预后，MDA含量降低，SOD活性提高，LDH和CK活性减弱。这说明辛伐他汀对I/R条件下远程器官心肌组织有保护作用。Bcl-2与Bax表达在假手术组的水平低，在肾I/R组增多，与I/R组相比，Bax的表达在辛伐他汀组明显降低，而Bcl-2的表达增加。这表明在肾的I/R过程中，心肌组织MDA含量和SOD活性发生变化，同时伴有过量细胞凋亡的发生，这与I/R时产生的大量自由基可能有一定关系。辛伐他汀可以清除多余的氧自由基，减少心肌细胞的氧化损伤，并可升高Bcl-2，降低Bax蛋白的表达，从而抑制细胞凋亡。

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Effects of simvastatin on expression of Bcl-2 and Bax in myocardium of rats with renal ischemia-reperfusion injury

JING Jiao, MA Hai-ling, YAN Wen-sheng, ZHANG Yong-zhong, ZHANG Yu-qing, JIAO Zong-wei

(ShijiazhuangMedicalCollege,Shijiazhuang050000,China.E-mail: 35982225@qq.com)

AIM: To observe the effect of simvastatin on myocardial tissue after renal ischemia-reperfusion injury and its mechanism.METHODSA rat model of renal ischemia-reperfusion injury was prepared by clamping the bilateral renal arteries for 45 min. The rats (n=36) were randomly divided into sham operation group, renal ischemia-reperfusion (I/R) group and simvastatin group with 12 rats in each group. The content of serum creatinine (SCr), blood urea nitrogen (BUN) and myocardial tissue malondialdehyde (MDA), the myocardial activity of lactate dehydrogenase (LDH), creatine kinase (CK) and superoxide dismutase (SOD), and the myocardial protein expression of Bcl-2 and Bax were detected.RESULTSCompared with sham operation group, the content of SCr, BUN and myocardial MDA， and the myocardial activity of LDH and CK in I/R group were significantly increased (P<0.05), and the activity of SOD was significantly decreased (P<0.05). Compared with I/R group, the content of SCr, BUN and myocardial MDA， and the myocardial activity of LDH and CK in simvastatin group were significantly decreased (P<0.05), while SOD activity was enhanced (P<0.05). The protein expression of Bcl-2 and Bax in sham operation group was less than that in I/R group (P<0.05), and the protein level of Bax in simvastatin group was significantly lower than that in I/R group (P<0.05), while the protein level of Bcl-2 was increased (P<0.05).CONCLUSIONSimvastatin has a protective effect on the myocardium of the rats with renal ischemia-reperfusion injury, and the protective mechanism may be related to the elimination of free radicals by simvastatin, increase in the protein expression of Bcl-2 and decrease in the protein expression of Bax.

Simvastatin; Renal ischemia-reperfusion injury; Myocardium; Malondialdehyde; Superoxide dismutase; Lactate dehydrogenase

1000- 4718(2017)12- 2274- 04

2017- 05- 10

2017- 07- 24

河北省教育厅高等学校科学技术指导性研究项目(No. Z2014020)

△通讯作者 Tel: 13473755521; E-mail: 35982225@qq.com

R363; R965

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.12.026

(责任编辑： 陈妙玲， 罗 森)