小檗碱减轻幽门螺杆菌诱导的人胃黏膜上皮细胞损伤*

陈宁南， 万 强

(1江西省人民医院急诊科， 2江西中医药大学附属医院心血管病科， 江西 南昌 330006)

小檗碱减轻幽门螺杆菌诱导的人胃黏膜上皮细胞损伤*

陈宁南1， 万 强2△

(1江西省人民医院急诊科，2江西中医药大学附属医院心血管病科， 江西 南昌 330006)

目的探讨小檗碱(Ber)对幽门螺杆菌(Hp)诱导的人胃黏膜上皮细胞GES-1损伤的保护作用及机制。方法采用Hp感染GES-1细胞，加入小檗碱(5，10和20 μmol/L)和细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)抑制剂PD98059(20 μmol/L)共培养。MTT法检测细胞活力，流式细胞术检测细胞凋亡,ELISA法检测细胞白细胞介素(IL)-1β及IL-8的水平，比色法检测细胞乳酸脱氢酶(LDH)活性并以Western blot法检测细胞Bax、Bcl-2、p-ERK1/2的蛋白水平。结果与对照组比较，Hp可抑制GES-1细胞活力、促进GES-1细胞凋亡、诱导GES-1细胞分泌IL-1β和IL-8、增加LDH活性、增加GES-1细胞内p-ERK1/2及Bax蛋白水平并降低Bcl-2蛋白水平，差异均有统计学显著性(P<0.05)；与Hp感染组比较，中、高剂量小檗碱均可逆转Hp对GES-1细胞活力、细胞凋亡、细胞IL-1β及IL-8分泌、LDH活性和GES-1细胞内p-ERK1/2、Bax及Bcl-2蛋白水平的影响，差异均有统计学显著性(P<0.05)；与高剂量小檗碱组比较，PD98059联合小檗碱可进一步逆转Hp对GES-1细胞上述指标的影响，差异均有统计学显著性(P<0.05)。结论小檗碱可通过抗炎、增加细胞活力和抗凋亡来减轻Hp诱导的GES-1细胞损伤，其机制可能与抑制ERK1/2通路有关。

小檗碱； 幽门螺杆菌； 细胞外调节蛋白激酶1/2； 人胃黏膜上皮细胞

幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，Hp)是革兰阴性微需氧菌，生存于胃和十二指肠内，感染后诱发的胃黏膜慢性炎症可损伤胃黏膜上皮细胞，发展为慢性活动性胃炎、胃和十二指肠溃疡，甚至参与胃淋巴瘤与胃癌的形成[1]。临床上多使用2种抗生素加质子泵抑制剂的三联疗法治疗Hp感染，但长期使用可显著增加Hp耐药，导致Hp根除率下降[2]。中医药对于慢性胃炎的疗效确切且副作用低，因此，积极研究并开发抑制Hp的中药或单体具有重要的医学价值。小檗碱(berberine，Ber)又名黄连素，是从黄连、黄柏和伏牛花等中药植物中提取的异喹啉生物碱，体外对多种革兰阳性及阴性菌均具显著的抑菌作用，临床广泛用于治疗胃肠感染和细菌性痢疾等消化性疾病[3]。研究表明，小檗碱可显著抑制由Hp感染导致的慢性胃炎的形成[4]，但具体分子机制有待进一步研究。细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)信号通路参与了调控炎症反应、细胞增殖及细胞凋亡等多种生理及病理进程[5]。为进一步探讨小檗碱在慢性胃炎中的可能作用靶点，本研究采用Hp感染人胃黏膜上皮GES-1细胞，加入小檗碱及ERK1/2选择性阻滞剂PD98059干预，探讨小檗碱对Hp诱导GES-1细胞损伤的影响及可能机制，为小檗碱的临床应用提供实验依据。

材 料 和 方 法

1 主要试剂与仪器

GES-1细胞株购于上海生博生物医药科技有限公司；盐酸小檗碱(HPLC≥98%)和MTT干粉均购自Sigma；Hp菌株购自ATCC细胞库；RPMI-1640培养基购自Invitrogen；PD98059购自Tocris Bioscience；胎牛血清购自Gibco；抗Bax、Bcl-2、t-ERK1/2、p-ERK1/2及β-actin抗体均购自Abcam；白细胞介素(interleukin，IL)-1β和IL-8 ELISA试剂盒均购自eBioscience；乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase，LDH)试剂盒购自南京建成生物工程研究所；Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒购自Beyotime。ST16型冷冻高速离心机购自Thermo；MK3型酶标仪、164-5050型电泳仪和2401型CO2细胞培养箱均购自Bio-Rad；FACSCalibur型流式细胞仪购自BD；DMI3000B型荧光倒置显微镜购自Leica。

2 方法

2.1Hp与GES-1细胞共培养及实验分组 将GES-1细胞接种至培养皿，置于含10% 胎牛血清的RPMI-1640培养基，于37 ℃、5% CO2培养箱内培养，细胞融合80%时传代。以无菌PBS液重悬Hp，2 000 r/min离心5 min，弃上清液后加含2% 胎牛血清的RPMI-1640培养基,调整Hp菌液浓度为1×1012CFU/L。GES-1细胞分为6组：(1)对照(control)组：只加RPMI-1640培养基；(2)Hp感染(Hp)组：加Hp菌液，以细菌∶细胞为200∶1的比例共培养24 h；(3)～(5)分别为小檗碱低剂量(Hp+Ber 5 μmol/L)、小檗碱中剂量(Hp+Ber 10 μmol/L)和小檗碱高剂量(Hp+Ber 20 μmol/L)组：分别以小檗碱(5、10和20 μmol/L)[6]预处理GES-1细胞30 min后,再加Hp菌液，以细菌∶细胞为200∶1的比例(预实验结果)共培养24 h；(6)PD98059组：以小檗碱20 μmol/L预处理GES-1细胞30 min后，加20 μmol/L PD98059[7]处理细胞30 min,再加Hp菌液以细菌∶细胞为200∶1的比例共培养24 h。

2.2MTT法检测细胞活力 将GES-1细胞按每孔1×104个接种至96孔板，每组设6个复孔，24 h后撤去血清，加入5 g/L的MTT液20 μL，培养4 h，弃上清液后，每孔加DMSO 150 μL,振荡溶解10 min，以570 nm为测定波长检测吸光度(A)值。细胞活力抑制率(%)=[1-(实验组A值/对照组A值)]×100%。

2.3流式细胞术检测细胞凋亡 将GES-1细胞按每孔2×105个接种至12孔板，24 h后换无血清的RPMI-1640培养基培养24 h，1 000 r/min离心5 min，加Annexin V-FITC及PI按说明书方法孵育，1 h内用流式细胞仪检测GES-1细胞的凋亡率。

2.4LDH活性及IL-1β和IL-8水平的测定 将GES-1细胞以1×104个接种至培养皿，收集上清液，用比色法测LDH活性，ELISA检测IL-1β及IL-8水平，检测按照试剂盒说明书操作。

2.5Western blot检测Bax、Bcl-2和p-ERK1/2蛋白的表达 提取GES-1细胞总蛋白，BCA法测蛋白浓度，100 ℃变性蛋白5 min，凝胶电泳，蛋白半干转印至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，加相应 I 抗(1∶1 000)于4 ℃孵育后，再加 II 抗(1∶2 000)于室温下孵育，ECL显影并拍照。Quantity One软件条带分析灰度，以β-actin作内参照。

3 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，实验数据采用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两组间比较用Bonferroni法，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 小檗碱及PD98059对GES-1细胞活力的影响

与对照组比较，Hp可显著抑制GES-1细胞活力，差异有统计学显著性(P<0.05)；与Hp感染组比较，小檗碱中、高剂量干预均可逆转Hp抑制GES-1细胞活力的作用，差异均有统计学显著性(P<0.05)；与小檗碱高剂量组比较，加入PD98059干预可进一步逆转Hp抑制GES-1细胞活力的作用，差异有统计学显著性(P<0.05)，见表 1。

2 小檗碱及PD98059对GES-1细胞凋亡的影响

与对照组比较，Hp可显著诱导GES-1细胞凋亡，差异有统计学显著性(P<0.01)；与Hp感染组比较，小檗碱中、高剂量干预均可逆转Hp诱导的GES-1细胞凋亡，差异均有统计学显著性(P<0.05)；与小檗碱高剂量组比较，加入PD98059干预可进一步逆转Hp对GES-1细胞凋亡的影响，差异有统计学显著性(P<0.05)，见表1。

表1小檗碱及PD98059对GES-1细胞活力及凋亡的影响

Table 1. The effects of berberine and PD98059 on the viability and apoptotic rate of GES-1 cells (Mean±SD.n=3)

GroupInhibitoryrateofcellactivity(%)Apoptoticrate(%)Control-10.53±2.18Hp41.63±6.14*36.47±5.52**Hp+Ber5μmol/L40.55±6.0235.91±5.97Hp+Ber10μmol/L28.13±5.19#28.13±4.48#Hp+Ber20μmol/L21.69±4.52#22.63±4.71#PD9805915.34±4.27#▲14.12±3.29#▲

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsHp group;▲P<0.05vsHp+Ber 20 μmol/L group.

3 小檗碱及PD98059对GES-1细胞LDH活性及IL-1β和IL-8水平的影响

与对照组比较，Hp可增加GES-1细胞上清中IL-1β和IL-8水平并增加LDH活性，差异均有统计学显著性(P<0.05)；与Hp感染组比较，小檗碱中、高剂量干预均可逆转Hp对GES-1细胞上清中IL-1β及IL-8水平及LDH活性的影响，差异均有统计学显著性(P<0.05)；与小檗碱高剂量组比较，加入PD98059干预可进一步增强小檗碱的作用，IL-1β、IL-8水平及LDH活性进一步降低，差异均有统计学显著性(P<0.05)，见表2。

表2小檗碱及PD98059对GES-1细胞LDH活性及IL-1β、IL-8水平的影响

Table 2. The effects of berberine and PD98059 on LDH activity, IL-1β and IL-8 levels of GES-1 cells (Mean±SD.n=3)

GroupLDH(U/L)IL-1β(ng/L)IL-8(ng/L)Control462.73±51.534.47±1.3620.76±6.61 Hp1481.27±130.62*90.13±9.04*215.88±23.73*Hp+Ber5μmol/L1476.52±137.8388.78±9.32212.50±21.85Hp+Ber10μmol/L1206.18±125.23#61.27±8.52#168.03±17.63#Hp+Ber20μmol/L871.86±103.24#37.38±7.98#104.74±12.47#PD98059609.54±82.13#▲20.42±5.59#▲59.36±10.71#▲

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsHp group;▲P<0.05vsHp+Ber 20 μmol/L group.

4 小檗碱及PD98059对GES-1细胞中Bax、Bcl-2和p-ERK1/2蛋白水平的影响

与对照组比较，Hp可增加GES-1细胞中Bax及p-ERK1/2的蛋白水平，并降低Bcl-2的蛋白水平，差异均有统计学显著性(P<0.05)；与Hp感染组比较，小檗碱中、高剂量干预均可逆转Hp对GES-1细胞中Bax、p-ERK1/2和Bcl-2蛋白水平的影响，差异均有统计学显著性(P<0.05)；与小檗碱高剂量组比较，加入PD98059干预可进一步增强小檗碱的作用，差异均有统计学显著性(P<0.05)，见图1。

讨 论

1983年,Marshall等[8]利用螺杆菌培养技术从慢性活动性胃炎患者的胃黏膜组织中首次成功分离Hp。Hp是目前所知唯一能在人胃中生存的微生物种类[9]。Hp感染后产生的尿素酶、黏液酶、脂多糖、磷脂酶、蛋白酶和过氧化物歧化酶等致病因子，可降低正常胃黏膜分泌的黏液中黏蛋白含量, 破坏黏液完整性，从而破坏胃黏膜屏障，导致慢性胃炎的发生[10]。

Hp还可破坏胃黏膜上皮的完整性。Hp感染后导致胃黏膜上皮细胞增殖与凋亡的平衡紊乱，可引起慢性胃炎和消化性溃疡等相关疾病的发生。Bax和Bcl-2是bcl-2基因家族中对于细胞凋亡起了调控作用的重要成员。bax是促凋亡基因，位于细胞质，可直接结合到线粒体膜上，改变细胞膜通透性，引起细胞色素C释放并激活caspases家族,从而促进细胞凋亡；bcl-2是抑凋亡基因，可通过抑制细胞线粒体膜电位的下降，减少细胞色素C释放进入细胞质，从而抑制细胞凋亡[11-13]。本研究中MTT检测结果显示，Hp可显著抑制GES-1细胞活力；流式细胞术检测结果显示Hp可增加GES-1细胞凋亡；Western blot检测结果显示Hp可增加GES-1细胞内Bax蛋白水平并减少Bcl-2蛋白水平，证实Hp可抑制GES-1细胞生长，并通过调控Bax及Bcl-2水平而促进GES-1细胞凋亡。

Figure 1. The effects of berberine and PD98059 on the protein levels of Bax, Bcl-2 and p-ERK1/2 in the GES-1 cells. A: control group; B: Hp group; C: Hp+Ber 5 μmol/L group; D: Hp+Ber 10 μmol/L group; E: Hp+Ber 20 μmol/L group; F: PD98059 group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsHp group;▲P<0.05vsHp+Ber 20 μmol/L group.

图1小檗碱及PD98059对GES-1细胞Bax、Bcl-2和p-ERK1/2蛋白水平的影响

Hp感染可诱导胃黏膜上皮炎症细胞的浸润，释放IL-1β和IL-8等前炎症介质，IL-1β和IL-8触发的级联反应可进一步导致细胞间黏附分子1和上皮细胞黏附分子过度活化，引起胃黏膜固有层中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞等聚集从而促进慢性胃炎的发生[14]。LDH是一种存在于机体所有组织细胞的细胞质内的糖酵解酶，当细胞受到损伤时细胞质内氧依赖性酶及细胞膜结构均发生改变，增加细胞膜通透性，使细胞外液LDH漏出量增加，因此LDH活性的高低可反映细胞损伤的程度[15]。本研究中ELISA法及比色法检测结果显示，Hp可增加GES-1细胞IL-1β及IL-8水平并增加LDH活性，证实Hp可诱导炎症导致GES-1细胞损伤。

既往研究表明，小檗碱在体内及体外均具有较强的抗Hp感染作用[4]。随着抗生素在Hp根除治疗中广泛应用，Hp多重耐药的发生率日益上升。主动外排系统hefA基因的高表达可导致体外人工诱导Hp多重耐药的发生[16]，小檗碱可通过下调hefA mRNA的表达，显著减轻四环素和阿莫西林等抗生素引起的Hp多重耐药的发生[17]。ERK1/2信号通路是细胞丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路家族的重要成员，可以被生长因子、离子射线和过氧化氢等激活，参与了调控炎症反应、细胞增殖及凋亡等多种生理及病理进程[5]。PD98059是常用的ERK1/2高效选择性阻滞剂，能特异地抑制MAPK激酶介导的MAPK活化，不会直接抑制ERK1/2[18]。本研究结果表明，Hp可显著增加GES-1细胞中p-ERK1/2的蛋白水平；小檗碱干预后可显著逆转Hp对GES-1细胞的影响；加入PD98059干预可进一步增强小檗碱的药理作用，提示小檗碱减轻Hp诱导的GES-1细胞损伤的机制可能与抑制ERK1/2通路有关。

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Effect of berberine on Helicobacter pylori-induced human gastric epithe-lial cells injury

CHEN Ning-nan1, WAN Qiang2

(1EmergencyDepartment,JiangxiProvincialPeople’sHospital,2DepartmentofMedicalCardiology,TheAffiliatedHospitalofJiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330006,China.E-mail:wanqiang109559140@163.com)

AIM: To investigate the effect of berberine (Ber) onHelicobacterpylori(Hp)-induced human gastric epithelial cells (GES-1) injury and the underlying mechanism.METHODSBerberine (5, 10 and 20 μmol/L) and PD98059 (20 μmol/L), a selective inhibitor of extracellular regulated protein kinases (ERK)1/2 signaling pathway, were added to Hp-infected GES-1 cells. The cell activity and apoptosis, the levels of interleukin (IL)-1β and IL-8, lactic dehydrogenase (LDH) activity and the protein levels of Bax, Bcl-2 and p-ERK1/2 in the GES-1 cells were determined by MTT assay, flow cytometry, ELISA, colorimetry and Western blot, respectively.RESULTSCompared with control group, Hp significantly inhibited the cell activity, increased the apoptotic rate, LDH activity, IL-1β and IL-8 levels, the Bax and p-ERK1/2 protein levels but decreased the Bcl-2 protein level in GES-1 cells (P<0.05). However, these effects of Hp were reversed by berberine at medium-dose and high-dose, as compared with the Hp-infected GES-1 cells (P<0.05). Moreover, the protective effects of berberine were significantly enhanced by the co-incubation of berberine with PD98059, as compared with the berberine at higher dose (P<0.05).CONCLUSIONBerberine may attenuate Hp-induced human gastric epithelial GES-1 cells injury by anti-inflammation, promoting cell growth and anti-apoptosis via the inhibition of ERK1/2 signaling pathway.

Berberine;Helicobacterpylori; Extracellular regulated protein kinase 1/2; Human gastric epithelial cells

1000- 4718(2017)12- 2283- 04

2017- 06- 21

2017- 08- 02

国家自然科学基金资助项目(No. 81660770)；江西省自然科学基金资助项目(No. 20161BAB215256)；江西省卫生计生委科技计划(No. 20171105)；江西省卫生计生委中医药科研课题(No. 2016A083)

△通讯作者 Tel: 0791-86360490; E-mail: wanqiang109559140@163.com

R285.5; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.12.028

(责任编辑： 卢 萍， 余小慧)