DJ-1对MPP+诱导的多巴胺能神经元损伤的保护机制研究

胡霞，陈方方，孔陈苏

(1.新疆医科大学第五附属医院神经内科，新疆 乌鲁木齐 830011；2.鄯善县人民医院医务部，新疆 鄯善 838200)

DJ-1对MPP+诱导的多巴胺能神经元损伤的保护机制研究

胡霞1，陈方方1，孔陈苏2

(1.新疆医科大学第五附属医院神经内科，新疆 乌鲁木齐 830011；2.鄯善县人民医院医务部，新疆 鄯善 838200)

目的探讨DJ-1基因对MPP+诱导的多巴胺能神经元损伤模型的保护机制。方法用神经生长因子(NGF)将PC12诱导成神经元样分化的细胞株(多巴胺能神经元)。用1-甲基-4苯基吡啶离子(MPP+)诱导帕金森病PC12细胞损伤模型，用CCK-8试剂盒检测细胞增殖活性，DHE染色法检测ROS水平变化。Western blot检测DJ-1和TH蛋白表达变化，RT-qPCR检测α-synuclein和凋亡相关基因的RNA水平。用pCDH1-cmv载体过表达DJ-1后检测DJ-1对MPP+环境中细胞的保护作用。用RT-qPCR检测α-synuclein、p53和Bax的表达变化。结果160 μmol/L的MPP+处理18 h后，PC12细胞活性降低，细胞内ROS水平升高，处理48 h后细胞凋亡增加。DJ-1和TH蛋白表达均明显下调，RNA水平上α-synuclein、p53和Bax表达增加。过表达DJ-1能够保护MPP+中的细胞活性，抑制ROS水平升高。α-synuclein以及凋亡基因p53和Bax的表达升高受到抑制，细胞凋亡减少。结论MPP+作用于多巴胺神经元，可以下调DJ-1和TH蛋白，促进α-synuclein积累ROS水平升高，并使p53和Bax表达增加，导致细胞凋亡增加。DJ-1基因能够能够在MPP+处理时抑制p53和Bax的表达，减少α-synuclein积累，降低细胞内ROS水平，保护细胞免受MPP+引起的损伤。

DJ-1；MPP+；帕金森病；神经元损伤

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一种常见的神经退行性疾病，其主要病理特征是中脑黑质多巴胺能神经元进行性变性坏死，临床特征包括肌强直、静止性震颤、运动迟缓及姿势步态异常等，帕金森病确切的发病机制目前尚不清楚，从而缺乏特异的神经保护治疗方法[1-4]。因此研究帕金森病的发病机制对帕金森病的治疗具有重要作用。

DJ-1是一个多功能蛋白，参与了基因的转录、分子伴侣、维持mRNA的稳定性、对抗氧化应激、细胞信号转导等众多过程，例如DJ-1基因缺陷增加对氧化应激的敏感性[5-6]，越来越多的研究表明DJ-1在帕金森病的发病机制中发挥着重要的作用[7-8]。过表达DJ-1可保护神经元免受氧化应激损伤[9-12]，提高HSP70的表达水平，抑制突变型α-突触核蛋白(α-synuclein)A53T引起的蛋白聚集和细胞毒性。这些研究揭示了DJ-1的生理学功能，使我们对帕金森病的发病机制有了更深层次的了解。本课题建立了MPP+诱导的帕金森病多巴胺能神经元细胞损伤模型，通过体外细胞实验进一步探究DJ-1对帕金森病多巴胺能神经元的保护作用及机制，为进一步揭示其与帕金森病发病的关系及研制开发抗帕金森病药物提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂 仪器：冷冻高速离心机(Thermo Fisher公司)；荧光显微镜(Olympus公司)；蛋白电泳仪(Bio-rad公司)；荧光定量PCR仪(Bio-rad公司)；酶标仪(Bio-rad公司)。试剂：1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)购自Sigma公司；DJ-1抗体、TH蛋白抗体和β-actin抗体均购自Abcom公司；大鼠嗜铬细胞瘤细胞系(PC12细胞)购自中科院上海细胞所，胎牛血清(Gibco公司)；CCK-8试剂盒购自BBI life sciences公司；RNA抽提试剂盒购自上海捷瑞生物公司；反转录及定量PCR试剂盒均购自TAKARA公司。

1.2 PC12细胞培养及诱导分化 PC12细胞株种植于含10%胎牛血清的RPM1640培养液，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。当单层培养细胞汇合后，传代培养，并加入100 ng/mL神经生长因子(NGF)进行诱导分化，将PC12细胞诱导为多巴胺能神经元后进行实验。

1.3 MPP+诱导的帕金森病PC12细胞模型建立 采用MPP+(1-甲基-4-苯基吡啶)诱导损伤的PC12细胞建立帕金森病细胞模型。PC12细胞接种于96孔板中，分别加入80 μmol/L、160 μmol/L、240 μmol/L的MPP+，空白对照组不加MPP+，分别作用8 h和16 h后，CCK-8法检测PC12细胞活性。

1.4 DHE检测细胞内ROS水平 分别加入50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L的MPP+处理PC12细胞3 h后，倒掉培养基，磷酸盐缓冲液(PBS)洗两遍。用5 μmol/L的DHE染色30 min，DAPI染核。荧光显微镜下观察拍照。

1.5 PI/Hoechst染色法检测细胞凋亡 PC12细胞接种于24孔板中，分别加入80 μmol/L、160 μmol/L、240 μmol/L 的 MPP+，空白对照组不加 MPP+。作用48 h后，用PI/Hoechst染色法显微镜线检测PC12细胞凋亡，并统计凋亡率。

1.6 Western blot 分别用80 μmol/L、160 μmol/L、240 μmol/L的MPP+处理PC12细胞8 h，收集细胞，加RIPA裂解液裂解细胞后，取上清液用BCA试剂盒检测蛋白浓度。聚丙烯酰胺凝胶电泳后采用半干法电转至PVDF膜上，一抗4℃孵育过夜，二抗孵育1 h后显色、曝光。抗体使用稀释比分别为：DJ-1 1:1 000，TH蛋白抗体1:2 000，β-actin 1:2 000。

1.7 荧光定量PCR检测 分别用80 μmol/L、160 μmol/L、240 μmol/L的MPP+处理PC12细胞8 h，将处理过的PC12细胞抽提总RNA，将500 ng总RNA用TaKaRa反转录试剂盒反转录成cDNA，稀释5倍后用荧光定量PCR检测。所用PCR引物如下，DJ-1正向引物：5'-GGTCCTACTGCTCTGTTG-3'，DJ-1反向引物：5'-GTTGTGACTTCCA-TACTTCC-3'；α-synuclein 正向引物：5'-CCTCAGCCCAGAGCCTTTC-3'，α-synuclein 反 向 引 物 ：5'-CCTCTGCCACACCCTGCTT-3'；Bax正向引物：5'-ACACCTGAGCTGACCTTGGA-3'，Bax反向引物：5'-CCGTGTCCACGTCAGCAATC-3'；p53正向引物：5'-GTACCGTATGAGCCACCTGAG-3'，p53反向引物：5'-CGTCCCAGAAGATTCCCA C-3'；β-actin(内参)正向引物：5'-AGAAAATCTGGCACCACACC-3'，β-actin(内参)反向引物：5'-CTCC TTAATGTCACGCACGA-3'。

1.8 统计学方法 应用SPSS13.0软件进行数据分析，组间均数比较采用单因素方差分析(ANOVA)中的SNK-q检验分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 MPP+对PC12细胞增殖活性的影响 MPP+对处理PC12细胞8 h和16 h后，用CCK-8法检测细胞增殖活性结果如图1所示，处理8 h只能引起细胞活性的轻微降低。MPP+浓度大于160 μmol/L时，处理16 h的PC12细胞活性明显降低。

图1 MPP+处理对PC12细胞增殖影响

2.2 MPP+处理对PC12细胞凋亡的影响 分别用不同浓度的MPP+处理PC12细胞48 h后，用PI/Hoechst染色法检测细胞凋亡情况。结果如图2所示，80 μmol/L MPP+只能引起轻微凋亡，MPP+浓度高于160 μmol/L时，细胞出现明显凋亡，凋亡率达到62%以上，240 μmol/L的MPP+能够引起85%的细胞凋亡。

图2 MPP+处理对PC12细胞凋亡的影响（×100）

2.3 MPP+处理对DJ-1表达的影响 Western blot检测发现，随着MPP+处理浓度的升高，DJ-1表达量逐渐减少(图3)。PD的病理学特征之一是纹状体多巴胺含量显著减少，而TH是多巴胺合成的限速酶[7]，所以TH蛋白的表达量也是PD的一个重要参数。通过Western blot检测发现TH蛋白的表达随着MPP+浓度的升高显著减少。

2.4 过表达DJ-1对MPP+诱导的PC12细胞凋亡的影响 在PC12细胞中过表达DJ-1后，用100 μmol/L的MPP+处理PC12细胞48 h，用PI/Hoechst染色法检测细胞凋亡情况。结果显示相对于空载体组(80%)，过表达DJ-1能够显著降低PC12细胞凋亡率(低于20%)(图4)。

2.5 过表达DJ-1对细胞内ROS水平的影响 MPP+处理PC12细胞8 h，用DHE探针检测细胞内的ROS水平。结果显示，160 μmol/L MPP+处理后，对照组内ROS水平明显上升。而过表达DJ-1后，ROS上升幅度受到抑制(图5)。

图3 Western blot检测MPP+处理对DJ-1和TH表达的影响

2.6 过表达DJ-1对DH蛋白表达的影响 荧光定量PCR检测发现，在RNA水平上，随着MPP+浓度的升高，DJ-1的表达逐渐减少，同时α-synuclein的表达逐渐增加。高浓度的MPP+处理使得p53表达增加，进而凋亡基因Bax的表达水平也增加。在细胞内过表达DJ-1后检测发现，DJ-1能够减少α-synuclein表达的增加幅度。p53和凋亡基因Bax的表达升高也受到抑制(图 6)。

图4 DJ-1对MPP+诱导的细胞凋亡的影响（×100）

图5 DJ-1对MPP+细胞内ROS水平的影响（×100）

图6 荧光定量PCR检测MPP+处理对凋亡基因表达的影响

3 讨 论

PD是一种神经系统变性疾病，常见于老年人。帕金森病的主要病理改变是中脑腹侧、特别是黑质致密部多巴胺能神经元进行性变性缺失。在生化方面的改变，研究发现是TH的缺失导致纹状体内多巴胺及其代谢产物含量的减少[15]，进而引起一系列的病变和临床症状。形态学研究发现PD患者脑内多巴胺能神经元的死亡方式呈凋亡样改变[16-17]。氧化应激反应被认为增强导致反应性氧自由基增多是引起PD黑质多巴胺能神经元凋亡的重要因素[18-21]。

DJ-1基因共有8个外显子，其中外显子1A和1B不参与编码蛋白质，2～7号外显子包含编码DJ-1蛋白[22]。研究表明PD的发生与线粒体功能障碍关系密切[23]。线粒体复合物Ⅰ功能障碍及氧化应激等对线粒体损伤可以导致PD的发生[24]，此外PD患者多巴胺神经元变性也与线粒体介导的细胞程序性死亡有关。因此DJ-1是一种重要的线粒体蛋白，在许多反应中发挥神经保护作用[25]。研究发现DJ-1在体内和体外均可与p53作用，过表达DJ-1能够抑制UV暴露条件下p53的转录活性而降低Bax表达，从而抑制小鼠成神经细胞瘤细胞的死亡[26]。

嗜黑质神经毒素1-甲基-4苯基四氢吡啶(MPTP)能引起人和动物出现类似帕金森病(PD)的病理生化改变。现已知MPTP在体内通过转化为1-甲基-4苯基吡啶离子(MPP+)从而损害黑质多巴胺神经元[27]。本文用神经生长因子(NGF)将PC12细胞诱导成多巴胺能神经元模型，然后用MPP+诱导的帕金森病PC12细胞损伤模型。结果显示160 μmol/L的MPP+能够显著抑制PC12细胞的细胞增殖活性，使细胞内ROS水平升高，并且长时间的MPP+处理能够引起PC12细胞发生凋亡。MPP+处理下调DJ-1蛋白和TH蛋白的表达。另外MPP+处理能够造成α-synuclein表达增加，同时p53和Bax的水平也升高。而过表达DJ-1能够有效抑制α-synuclein、p53和Bax表达升高，降低细胞内的ROS水平，减少PC12细胞免受MPP+造成的损伤导致的凋亡。这些结果证明DJ-1是一种重要的保护性蛋白，在许多反应中发挥神经保护作用。这为帕金森病等神经退行性疾病提供了一个新的靶点。DJ-1参与多巴胺神经元损伤保护的机制尚未完全清楚，随着对DJ-1的进一步研究，必将为帕金森病的临床治疗带来曙光。

[1]柏秀娟,尚延昌,王炜,等.帕金森病的研究进展[J].现代生物医学进展,2010,10(1):178-181.

[2] 张庆云,董晓东,郝媛,等.帕金森病发病机制研究[J].医学研究与教育,2013,30(3):85-88.

[3]李立宏,高国栋,安炜琪,等.帕金森病神经元死亡机制:bcl-2与多巴胺诱导PC12细胞凋亡的相关性研究[J].现代康复,2001,5(12):44-45.

[4]张海娜,胡国华,陈秋惠,等.帕金森病细胞模型的建立及鱼藤酮对多巴胺能神经元的毒性作用[J].吉林大学学报(医学版),2007,33(5):811-815.

[5]Gu L,Cui T,Fan C,et al.Involvement of ERK1/2 signaling pathway in DJ-1-induced neuroprotection against oxidative stress[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2009,383(4):469-474.

[6]Joungil C,Cameron SM,Olzmann JA.Oxidative damage of DJ-1 is linked to sporadic Parkinsonband alzheimer diseases[J].J Biol Chem,2006,281(16):10816-10824.

[7]Zhou W,Freed C R.DJ-1 up-regulates glutathione synthesis during oxidative stress and inhibits A53T alpha-synucleintoxicity.The Journal of Biological Chemistry,2005,280(52):43150-43158.

[8]Sun SY,An CN,Pu XP.DJ-1 protein protects dopaminergic neurons against 6-OHDA/MG-132-induced neurotoxicity in rats.Brain Research Bulletin,2012,88(6):609-616.

[9]Aleyasin H,Rousseaux MW,Phillips M,et al.The Parkinson's disease gene DJ-1 is also a key regulator of stroke-induced damage[J].Proc NatlAcad Sci USA,2007,104(47):18748-18753.

[10]Lev N,Barhum Y,Pilosof NS,et al.DJ-1 protects against dopamine toxicity:Implications for Parkinson's disease and aging[J].J GerontolABiol Sci Med Sci,2013,68(3):215-225.

[11]Mullet SJ,Di Maio R,Greenamyre JT,et al.DJ-1 expression modulates astrocyte-mediated protection against neuronal oxidative stress[J].J Mol Neurosci,2012,49(3):507-511.

[12]Goldberg JA,Guzman JN,Estep CM,et al.Calcium entry induces mitochondrial oxidant stress in vagal neurons at risk in Parkinson's disease[J].Nat Neurosci,2012,15(10):1414-1421.

[13]van der Brug MP,Blackinton J,Chandran J,et al.RNA binding activity of the recessive parkinsonism protein DJ-1 supports involvement in multiple cellular pathways[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(29):10244-10249.

[14]Hao LY,Giasson BI,Bonini NM.DJ-1 is critical for mitochondrial function and rescues PINK1 loss of function[J].Proc Natl Acad Sci USA,2010,107(21):9747-9752.

[15]Gerfen CR,McGinty JF,Young WS.Dopamine differentially regulates dynorphin,substance P,and enkephalin expression in striatal neurons:in situ hybridization histochemical analysis[J].J Neurosci,1991,11(4):1016-1031.

[16]黄觉斌.帕金森病的危险因素及其预防[J].现代康复,2000,4(2):163-165.

[17]荣娟,陈生弟.帕金森病的遗传因素[J].现代康复,2000,4(2):171-173.

[18]CW Olanow,MD FR CP.Oxidation reactions in Parkinson's disease[J].Neurology,1990,40(suppl 3):32-37.

[19]BarzilaiA,Daily D,Melamed E,et al.Activation of nuclear transcription factor kappa B(NF-κB)is essential for dopamine-induced apoptosis in PC12 cells[J].Neurochem,2001,77(2):391-398.

[20]Gibson GE,DE Giorgio LA,Zhang H,et al.Dopaminergic cell death induced by MPP+,oxidant and specific neurotoxicants shares the common molecularmechanism [J].Neurochem,2001,76(4):1010-1021.

[21]Spina MB,Cohen G.Dopamine turnover and glutathione oxidation implication for Parkinson's disease[J].Proc Natl Acad Sci USA,1989(86):1398-1400.

[22]Vasseur S,Afzal S,Tardivel-Lacombe J,et al.DJ-1/PARK7 is an important mediator of hypoxia-induced cellular responses[J].Proc Natl Acad Sci USA,2009,106(4):1111-1116.

[23]Martin LJ.Biology of mitochondria in neurodegenerative diseases[J].Prog Mol Biol Transl Sci,2012,107(1):355-415.

[24]Koopman WJ,Nijtmans LG,DieterenCE,et al.Mammalian mitochondrial complex I:biogenesis,regulation,and reactive oxygen species generation[J].Antioxid Redox Signal,2010,12(12):1431-1470.

[25]Gao H,Yang W,Qi Z,et al.DJ-1 protects dopaminergic neurons against rotenone-induced apoptosis by enhancing ERK-dependent mitophagy[J].J MolBiol,2012,423(2):232-248.

[26]Fan J,Ren H,Jia N,et al.DJ-1 decreases Bax expression through repression p53 transcriptional activity[J].J Biol Chem,2008,283(7):4022-4030.

[27]Story E,Hyman BT,Jenkins B,et al.1-Methy1-4phenylepyidinium produces excitotoxic lesions in rat striatum as a result of impairment of oxidative metabolism[J].J Neurochem,1992,58(5):1975-1978.

Protective mechanism of DJ-1 on MPP+induced PD dopaminergic neurons damage.

HU Xia1,CHEN Fang-fang1,KONG Chen-su2.1.Department of Internal Medicine-Neurology,the Fifth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Urumqi 830011,Xinjiang,CHINA;2.Medical Administration Division,Shanshan People's Hospital,Shanshan 838200,Xinjiang,CHINA

ObjectiveTo investigate the protective mechanism of DJ-1 on 1-methy-4-phenylpyridinium(MPP+)induced Parkinson's disease(PD)PC12 dopaminergic neurons cell damage.MethodsPC12 cells were induced into neurons differentiated cells(dopaminergic neurons)using nerve growth factor(NGF).MPP+was applied to induce PC12 cell injury model of PD.Cell activity was detected by CCK-8 cell proliferation kit.The change of reactive oxygen species(ROS)levels was monitored by using dihydro-ethidium(DHE).The expression levels of DJ-1 and TH protein were detected by Western blot.The RNA level of α-synuclein and apoptosis related genes(p53 and Bax)were detected by RT-qPCR.DJ-1 expressing vector was constructed and transfected into PC12 cells,MPP+was used to induce dopaminergic neuron injury model.ResultsAfter processed with 160 μmol/L MPP+for 18 h,PC12 cell viability was decreased,and the level of endogenous ROS was increased.After processed with MPP+for 48 h,apoptosis was increased,the expression of DJ-1 and TH protein were significantly decreased,and RNA level of α-synuclein,Bax and p53 were all increased.In DJ-1 overexpression cells,the decrease of cell viability and apoptosis induced by MPP+were weaken,the RNA level of α-synuclein,p53,Bax and caspase apoptosis didn't emerge an obvious increasing any more.ConclusionMPP+can cause the down-regulation of DJ-1 and TH protein.In addition,MPP+up-regulate the expression of α-synuclein,Bax and p53,which led to cell apoptosis.DJ-1 can suppress the change of α-synuclein,Bax and p53,reduce accumulation of α-synuclein,and protect cells from MPP+induced damage.

DJ-1;1-methy-4-phenylpyridinium(MPP+);Parkinson's disease(PD);Nerve damage

R741.02

A

1003—6350（2017）22—3622—05

孔陈苏。E-mail：944603402@qq.com

2016-12-23)