一平浪盐矿产蛋白酶嗜盐古菌的鉴定及其酶学性质

,, , ,

(江苏大学食品与生物工程学院,江苏镇江 212013)

一平浪盐矿产蛋白酶嗜盐古菌的鉴定及其酶学性质

侯靖,徐佳琪,李杨,周瑶,崔恒林*

(江苏大学食品与生物工程学院,江苏镇江 212013)

从分离自一平浪盐矿的嗜盐古菌中筛选产胞外蛋白酶菌株,并对所产蛋白酶的酶学性质进行初步研究。结果表明,2株高产胞外蛋白酶嗜盐古菌YPL20和YPL26为盐矿盐古球菌(Halococcussalifodinae)。YPL20胞外蛋白酶最适反应条件为50 ℃,pH9.0和0 mol/L NaCl。YPL26胞外蛋白酶最适反应条件为50 ℃,pH7.0～9.0和2.5 mol/L NaCl。它们具有良好的热稳定性、酸碱稳定性和盐度耐受性。Mn2+、Ca2+对YPL20和YPL26的蛋白酶活性均有促进作用,而Cu2+、Zn2+均有抑制作用。丝氨酸蛋白酶抑制剂完全抑制YPL20和YPL26的蛋白酶活性,说明YPL20和YPL26的胞外蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。

胞外蛋白酶,嗜盐古菌,酶学性质,盐矿盐古球菌

蛋白酶催化蛋白质肽键的水解,是一种重要的工业酶制剂,目前广泛应用于食品、洗涤、医药、废物处理等工业领域[1]。然而,普通的蛋白酶在高盐或低水活度条件下会变性失活,从而限制了其在高盐发酵食品或高盐污水处理等特殊领域的应用。

嗜盐古菌是一类通常生活在盐湖、晒盐场、盐矿以及高盐腌制食品等高盐环境的微生物。由于其特殊的生存环境,嗜盐古菌胞外酶大多具有耐盐、耐有机溶剂的特性,能够在高盐或低水活度条件下维持高活性和稳定性。因而,嗜盐古菌胞外蛋白酶能够拓宽普通蛋白酶的催化和应用范围,成为近年来国内外学者的研究热点。Akolkar等人对Halobacteriumsp. SP1(1)胞外蛋白酶的酶学性质进行了研究[2],并以此为基础改良了传统鱼露发酵工艺,缩短了鱼露发酵时间[3]。Dammak等人发现HalorubrumezzemoulenseETR14的胞外蛋白酶具有耐盐碱、热稳定的特征[4]。Elbanna等人报道了Halobacteriumsp. HP25胞外蛋白酶耐盐碱、耐热的特性,并且能够耐受一定的有机溶剂和表面活性剂[5]。石万良等人对Natrinemasp. R6-5所产胞外蛋白酶进行了纯化以及酶学性质表征[6]。高瑞昌等人研究了HalogranumrubrumRO2-11胞外蛋白酶的特性[7]。然而,相对于丰富的嗜盐古菌资源,对其胞外蛋白酶的研究尚处于起步阶段,尤其是对环境具有广适性的蛋白酶资源仍有很大挖掘空间[5]。

我国有很多独特的高盐环境,如盐湖、盐田、盐矿等,其中蕴藏着丰富的嗜盐古菌酶资源有待发掘。本研究从分离自云南一平浪盐矿的嗜盐古菌中筛选高产胞外蛋白酶菌株,并对所产蛋白酶的酶学性质进行初步研究,为进一步分离纯化及工业应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

62株嗜盐古菌 分离自云南一平浪盐矿;酵母粉、蛋白胨 OXOID试剂公司;酸水解酪素 Difco公司;酪蛋白、PCR扩增试剂盒、脱脂奶粉 上海生工生物技术服务有限公司;其它试剂 国药集团化学试剂有限公司;NHM培养基成分(g/L) 酵母提取物0.05,鱼蛋白胨0.25,丙酮酸钠1.0,KCl 5.4,CaCl20.29,NH4Cl 0.27,MgSO4·7H2O 26.8,MgCl2·6H2O 23.0,NaCl 184.0,K2HPO40.3,pH7.0～7.2;HM培养基成分(g/L) 酵母提取物1.0,鱼蛋白胨1.0,KCl 5.4,K2HPO40.3,CaCl20.29,NH4Cl 0.27,MgSO4·7H2O 26.8,MgC2·6H2O 23.0,NaCl 184.0,pH7.0～7.2;CM培养基成分(g/L) 酸水解酪素7.5,酵母提取物10.0,柠檬酸三钠3.0,KCl 2.0,MgSO4·7H2O 20.0,FeSO4·7H2O 0.05,NaCl 200.0,pH7.0～7.2;固体培养基添加2%琼脂;缓冲液 50 mmol/L磷酸-氢氧化钠缓冲液(pH6.0),50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.0、8.0、9.0),50 mmol/L硼砂-氢氧化钠缓冲液(pH10.0、11.0),以及含有不同NaCl浓度的相应pH的缓冲液。

超净工作台 苏州净化设备有限公司;LRH-250生化培养箱 上海一恒科技有限公司;电子天平 上海精科天平仪器厂;全自动灭菌锅 上海三申医疗器械有限公司;pHS-3TC型酸度计 上海天达仪器有限公司;DYY-6C型电泳仪 北京市六一仪器厂;HBA-1151PCR仪 MJ Research公司;HH-S2数显恒温水浴锅 江苏省金坛市医疗仪器厂;DU800TM核酸蛋白分析仪 Beckman-Coulter公司;Avanti J-14离心机 Beckman公司;HYG-C型多功能摇床 太仓实验设备厂。

1.2 实验方法

1.2.1 产胞外蛋白酶菌株筛选 配制含0.5%(m/v)脱脂奶粉的NHM平板,取5 μL经NHM培养基活化后的菌液接种到NHM-脱脂奶粉平板,于37 ℃培养箱培养4 d形成明显的菌苔后,观察菌苔周围是否产生蛋白水解透明圈。产胞外蛋白酶菌株的菌苔周围有透明圈,不产胞外蛋白酶菌株的菌苔周围没有透明圈,根据透明圈直径与菌苔直径之比初步评价产蛋白酶能力。

1.2.2 16S rRNA和rpoB′基因序列分析 取少量菌体加入30～50 μL无菌水,100 ℃加热10 min裂解细胞,作为PCR扩增DNA的模板。16S rRNA基因扩增的正反向引物分别为引物0018F和1518R[8]。rpoB′基因扩增的正反向引物分别为引物HrpoB2 1420F和HrpoA 153R[9]。PCR反应体系25 μL,热循环参数:95 ℃预变性5 min,95 ℃变性30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,循环30次,72 ℃后延伸10 min。PCR产物测序由北京诺赛基因组研究中心完成。基因序列经NCBI BLAST分析,获得相关模式菌株的16S rRNA和rpoB′基因序列,使用GeneDoc软件进行多重序列比对。

1.2.3 培养基对YPL20和YPL26产胞外蛋白酶能力的影响 分别配制含0.5%(m/v)脱脂奶粉的NHM、HM和CM平板,取5 μL经NHM、HM和CM培养基活化后的YPL20和YPL26菌液分别接种到NHM、HM和CM-脱脂奶粉平板,于37 ℃培养箱培养4 d形成明显的菌苔后,观察菌苔周围蛋白水解透明圈的大小。

1.2.4 粗酶液的制备 YPL20和YPL26菌株经NHM液体培养基活化后,以2%的比例接种于200 mL NHM培养基中,37 ℃,160 r/min培养6 d至稳定期。培养液于4 ℃,9000×g离心15 min,上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤,再采用截留分子量为10 kDa的超滤离心管(Millipore)超滤浓缩10倍,浓缩液即为胞外蛋白酶粗酶液。

1.2.5 蛋白酶活力的测定

1.2.5.1 酪蛋白溶液的配制 为了研究蛋白酶酶学性质,配制不同pH、不同NaCl浓度的酪蛋白溶液。称取2.00 g干酪素,加入10 mL 0.1 mol/L氢氧化钠溶液润湿后,加入70 mL一定pH、NaCl浓度的缓冲液(详见1.2.6),于沸水浴中加热至酪蛋白完全溶解,用此缓冲液定容至100 mL。

1.2.5.2 蛋白酶活力的测定 参照福林酚法测定蛋白酶活力[10]。蛋白酶将酪蛋白水解成酪氨酸等物质,利用酪氨酸标准曲线,得出酪氨酸的量计算蛋白酶活力。

将100 μg/mL L-酪氨酸标准溶液分别稀释成0.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 μg/mL,取0.5 mL上述各稀释液(做三次平行实验),分别加入2.5 mL 0.4 mol/L Na2CO3溶液和0.5 mL 33%福林酚试剂,40 ℃显色20 min,于4 ℃,9000×g离心10 min后,取上清液于680 nm测定吸光度。以不含酪氨酸的反应体系调零,分别测定吸光度值。以酪氨酸浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线,得标准曲线方程y=0.017x-0.0002。

用一定pH、NaCl浓度的缓冲液(详见1.2.6)将酶液稀释10倍,取250 μL酶液加入250 μL此缓冲液配制的酪蛋白溶液,一定温度下反应30 min,加入500 μL 10%三氯乙酸溶液终止反应。37 ℃放置30 min后,于4 ℃,9000×g离心10 min,取500 μL上清液加入2.5 mL 0.4 mol/L Na2CO3溶液和0.5 mL 33%福林酚试剂,40 ℃显色20 min,于4 ℃,9000×g离心10 min,取上清液于680 nm测定吸光度。同时设置空白对照,即在酶液中先加入三氯乙酸溶液,后加入酪蛋白溶液。在特定反应条件下,每分钟水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸定义为1个酶活力单位(U)。

1.2.6 酶学性质的研究

1.2.6.1 最适反应温度 用2 mol/L NaCl,pH7.0缓冲液将25 μL酶液稀释10倍后,按上述蛋白酶活力的测定方法,与250 μL相应酪蛋白溶液分别在35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 ℃下反应,测定酶活力。

1.2.6.2 热稳定性 用2 mol/L NaCl,pH7.0缓冲液将25 μL酶液稀释10倍后,在30、50、70、90 ℃下分别放置0、20、40、60 min,按上述蛋白酶活力的测定方法,与250 μL相应酪蛋白溶液在最适温度下反应,测定酶活力。

1.2.6.3 最适反应pH 将25 μL酶液分别用含2 mol/L NaCl的pH6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0缓冲液稀释10倍后,按上述蛋白酶活力的测定方法,与250 μL相应酪蛋白溶液在最适温度下反应,测定酶活力。

1.2.6.4 酸碱稳定性 将25 μL酶液分别用含2 mol/L NaCl的pH6.0、8.0、10.0缓冲液稀释10倍后,于30 ℃放置0、20、40、60 min,按上述蛋白酶活力的测定方法,与250 μL含2 mol/L NaCl的最适pH的酪蛋白溶液在最适温度下反应,测定酶活力。

1.2.6.5 最适反应NaCl浓度 将25 μL酶液分别用含有0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mol/L NaCl的缓冲液稀释10倍,按上述蛋白酶活力的测定方法,与250 μL相应酪蛋白溶液在最适温度、最适pH下反应,测定酶活力。

1.2.6.6 NaCl浓度稳定性 将25 μL酶液分别用含有0、1.0、2.0、3.0 mol/L NaCl的缓冲液稀释10倍,在30 ℃放置0、20、40、60 min,按上述蛋白酶活力的测定方法,随后分别与250 μL含3.0、2.0、1.0、0 mol/L NaCl的酪蛋白溶液在最适温度、最适pH下反应,测定酶活力。

1.2.6.7 金属离子对蛋白酶活力的影响 最适缓冲液稀释10倍后的250 μL酶液中分别加入终浓度为5 mmol/L的KCl、CaCl2、ZnSO4、CuSO4、FeCl2、MnCl2、MgCl2,30 ℃放置20 min,按上述蛋白酶活力的测定方法,在最适条件下测定酶活力。设置不加金属离子的对照反应体系。

1.2.6.8 抑制剂对蛋白酶活力的影响 最适缓冲液稀释10倍后的250 μL酶液中分别加入4 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)、1 mmol/L对-氯汞基苯甲酸(PCMB)、10 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、0.1 mmol/L胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin A),30 ℃放置20 min,按上述蛋白酶活力的测定方法,在最适条件下测定酶活力。设置不加抑制剂的对照反应体系。

1.3 数据处理

数据测定三次,以“平均值±标准差”表示,用SPSS 18.0进行显著性分析,显著水平设为0.05,极显著水平设为0.01。

2 结果与分析

2.1 高产胞外蛋白酶菌株的筛选和鉴定

分离自云南一平浪盐矿的62株嗜盐古菌中,YPL20和YPL26在NHM-脱脂奶粉平板上产生的水解圈直径与菌苔直径之比最大。16S rRNA基因序列分析表明,YPL20和YPL26的16S rRNA基因序列完全一致,与盐矿盐古球菌(Halococcussalifodinae)DSM 8989菌株的16S rRNA基因序列的一致性为100%。rpoB′基因序列分析表明YPL26的rpoB′基因序列与H.salifodinaeDSM 8989的一致性为100%,而YPL20与其一致性为99.6%。因此,YPL20与YPL26为H.salifodinae的不同菌株。盐古球菌属(Halococcus)尚未有任何菌株被报道能够产生胞外蛋白酶,因而将本研究筛选到的两株高产蛋白酶的盐矿盐古球菌YPL20和YPL26用作进一步研究对象。

2.2 培养基对YPL20和YPL26产胞外蛋白酶能力的影响

从图1可以看出,YPL20和YPL26在氮源匮乏的NHM-脱脂奶粉平板上的水解圈直径大于氮源适中的HM-脱脂奶粉平板,而在氮源丰富的CM-脱脂奶粉平板上未产生明显的水解圈。说明当培养基中存在丰富的可利用的氨基酸、多肽时,细胞不会产生胞外蛋白酶。类似地,D’Alessandro等人研究发现营养受限的条件能够促进Natrialbamagadii产生胞外蛋白酶[11]。

图1 YPL26和YPL20在脱脂奶粉平板上培养4 d产生的水解圈Fig.1 Hydrolysis zones of YPL26 and YPL20 cultured on milk agar plates for 4 days注:左侧为YPL26菌株,右侧为YPL20菌株;(a)NHM-脱脂奶粉平板,(b)HM-脱脂奶粉平板,(c)CM-脱脂奶粉平板。

2.3 YPL20和YPL26胞外蛋白酶酶学性质研究

2.3.1 最适反应温度与热稳定性 基于以上结果,NHM培养基用于培养YPL20和YPL26菌株并制备粗酶液进行酶学性质表征。从图2可以看出,YPL20和YPL26的蛋白酶在35～90 ℃内均有酶活,随着温度升高,酶活先增加后降低,最适反应温度均为50 ℃。YPL20的蛋白酶在65～90 ℃酶活力基本保持不变,约为最高酶活的50%。YPL26的蛋白酶在45～75 ℃内具有较高酶活(最高酶活的90%以上)。因此,YPL20和YPL26的胞外蛋白酶具有良好的耐热性,其中YPL26蛋白酶的耐热性更好。

图2 YPL20和YPL26蛋白酶的最适反应温度Fig.2 The optimum temperature for protease activities of YPL20 and YPL26

从图3可以看出,YPL20的蛋白酶在30 ℃具有良好的稳定性,在50 ℃随着处理时间增加酶活逐渐降低,处理60 min后蛋白酶活性降低31%。在70、90 ℃处理出现瞬时失活效应,即放置20 min后,蛋白酶活性降低了约46%,延长放置时间,蛋白酶活力基本不变。YPL26的蛋白酶在30、50 ℃具有良好的稳定性,在70、90 ℃随着处理时间延长酶活逐渐降低。70 ℃放置60 min后,蛋白酶活力降低16%;90 ℃放置60 min,蛋白酶活力降低28%。因此,YPL20和YPL26的胞外蛋白酶具有一定的热稳定性,与最适反应温度结果类似,YPL26胞外蛋白酶的热稳定性优于YPL20。蛋白酶良好的耐热性和热稳定性对于工业应用非常重要,因为很多工业过程,如食品发酵过程,均需要维持一定温度。

图3 不同温度处理对YPL20(a)和YPL26(b)蛋白酶活力的影响Fig.3 Effect of pre-incubation at different temperatures on protease activities of YPL20(a)and YPL26(b)

2.3.2 最适反应pH与酸碱稳定性 从图4可以看出,YPL20和YPL26的胞外蛋白酶在pH6.0～11.0范围内均具有一定的活性,随着pH的升高,酶活先升高后降低。YPL20蛋白酶的最适反应pH为9.0。pH为11时,酶活力最低,为最高酶活的53%。YPL26胞外蛋白酶的最适pH为7.0～9.0,当pH低于或高于最适pH时,蛋白酶活力迅速降低。YPL20和YPL26的胞外蛋白酶均属于碱性蛋白酶。

图4 YPL20和YPL26蛋白酶的最适反应pHFig.4 The optimum pH for protease activities of YPL20 and YPL26

图5 不同pH处理对YPL20(a)和YPL26(b)蛋白酶活力的影响Fig.5 Effect of pre-incubation at different pH values on protease activities of YPL20(a)and YPL26(b)

从图5可以看出,YPL20和YPL26的胞外蛋白酶在pH6.0～10.0处理60 min酶活均没有显著变化,说明YPL20和YPL26的蛋白酶具有良好的酸碱稳定性,将具有广泛的应用前景。

2.3.3 最适反应NaCl浓度与盐度稳定性 普通的蛋白酶在高盐条件下会变性失活,而嗜盐古菌蛋白质通过增加蛋白表面的酸性氨基酸残基以形成负电屏蔽,从而在蛋白周围形成一层水化层来维持在高盐环境中的活性和稳定性[12]。从图6可以看出,YPL20和YPL26蛋白酶在0～3 mol/L NaCl浓度范围内均具有一定的活力。YPL20蛋白酶的最适反应NaCl浓度为0 mol/L,随着NaCl浓度升高,蛋白酶活性下降。当NaCl浓度升至3 mol/L时,其活性降为最高活性的43%。YPL26蛋白酶活力随着NaCl浓度增加先升高后降低,最适反应NaCl浓度为2.5 mol/L,在1.5～3.0 mol/L NaCl浓度范围内,具有较高活性(最高酶活的80%以上)。目前报道的很多嗜盐古菌胞外蛋白酶仅能在高盐条件下发挥催化活性,在低盐条件下会失活,如HalogeometricumborinquenseTSS101[13]、Natronococcusoccultus[14]的胞外蛋白酶在不存在NaCl的条件下不具有酶活力。相比而言,YPL20和YPL26的蛋白酶具有较广的盐浓度适应性。

图6 YPL20和YPL26蛋白酶的最适反应NaCl浓度Fig.6 The optimum NaCl concentration for protease activities of YPL20 and YPL26

从图7可以看出,YPL20胞外蛋白酶在0、1.0、2.0 mol/L NaCl中具有良好的稳定性,在3 mol/L NaCl中随着处理时间增加,酶活力稍有降低,处理40～60 min后,酶活降低约13%。YPL26胞外蛋白酶在0、1.0、2.0、3.0 mol/L NaCl中均具有良好的稳定性。YPL20和YPL26胞外蛋白酶对低盐和高盐浓度均有较好的耐受性,因而应用范围更为广泛。

图7 不同NaCl浓度处理对YPL20(a)和YPL26(b)蛋白酶活力的影响Fig.7 Effect of pre-incubation at different NaCl concentrations on protease activities of YPL20(a)and YPL26(b)

2.3.4 金属离子对蛋白酶活性的影响 不同的金属离子对不同的蛋白酶活力影响不同。从图8可以看出,K+、Mg2+对YPL20蛋白酶活力没有显著影响(p>0.05),Ca2+、Mn2+使YPL20胞外蛋白酶活力分别提高了39%和72%,Zn2+、Cu2+、Fe2+使蛋白酶活力分别降低了49%、63%和69%。K+、Mg2+、Fe2+对YPL26胞外蛋白酶活力没有显著影响(p>0.05)。Ca2+、Mn2+使YPL26胞外蛋白酶活性分别提高了22%和102%。Zn2+、Cu2+使YPL26蛋白酶活性分别降低了51%和69%。因此,在工业应用中可以通过添加Ca2+、Mn2+提高YPL20和YPL26蛋白酶酶活。

图8 金属离子对YPL20和YPL26蛋白酶活力的影响Fig.8 Effect of metal ions on protease activities of YPL20 and YPL26

2.3.5 抑制剂对蛋白酶活性的影响 根据活性中心的功能基团,蛋白酶主要分为丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和金属蛋白酶[15]。从图9可以看出,丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF使YPL20和YPL26胞外蛋白酶完全失活(p<0.01),说明YPL20和YPL26的胞外蛋白酶可能是丝氨酸蛋白酶。半胱氨酸蛋白酶抑制剂PCMB使YPL20和YPL26胞外蛋白酶活力分别降低了97%和75%,表明半胱氨酸对于YPL20和YPL26蛋白酶活性具有非常重要的作用。金属蛋白酶抑制剂EDTA使YPL20和YPL26胞外蛋白酶活力分别降低了40%和29%,可能通过螯合Ca2+、Mn2+等金属离子使酶活性中心失去辅因子从而抑制酶活。天冬氨酸蛋白酶抑制剂Pepstatin A对酶活没有显著影响(p>0.05)。因此,YPL20和YPL26的胞外蛋白酶可能是丝氨酸蛋白酶,目前报道的嗜盐古菌胞外蛋白酶多为丝氨酸蛋白酶[16]。

图9 抑制剂对YPL20和YPL26蛋白酶活力的影响Fig.9 Effect of inhibitors on protease activities of YPL20 and YPL26

3 结论

从分离自云南一平浪盐矿的嗜盐古菌中筛选出两株高产胞外蛋白酶嗜盐古菌YPL20和YPL26,经16S rRNA和rpoB′基因序列分析鉴定为盐矿盐古球菌(Halococcussalifodinae)。YPL20胞外蛋白酶最适反应条件为50 ℃,pH9.0和0 mol/L NaCl。YPL26胞外蛋白酶最适反应条件为50 ℃,pH7.0～9.0和2.5 mol/L NaCl。它们具有良好的耐热性、酸碱稳定性,对低盐和高盐浓度均有较好的耐受性,因而具有广泛的应用前景。Mn2+、Ca2+对YPL20和YPL26的蛋白酶活性均有促进作用。YPL20和YPL26胞外蛋白酶可能是丝氨酸蛋白酶,半胱氨酸对于活性发挥也有着重要的作用。YPL20和YPL26胞外蛋白酶酶学特性的研究为其进一步分离纯化及在工业技术领域的潜在应用奠定基础。

[1]Rao M B,Tanksale A M,Ghatge MS,et al. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews,1998,62:597-635.

[2]Akolkar A V,Deshpande G M,Raval K N,et al. Organic solvent tolerance ofHalobacteriumsp. SP1(1)and its extracellular protease[J]. Journal of Basic Microbiology,2008,48(5):421-425.

[3]Akolkar A V,Durai D,Desai A J.Halobacteriumsp. SP1(1)as a starter culture for accelerating fish sauce fermentation[J]. Journal of Applied Microbiology,2010,109(1):44-53.

[4]Dammak D F,Smaoui S M,Ghanmi F,et al. Characterization of halo-alkaline and thermostable protease fromHalorubrumezzemoulensestrain ETR14 isolated from Sfax solar saltern in Tunisia[J]. Journal of Basic Microbiology,2016,56(4):337-346.

[5]Elbanna K,Ibrahim I M,Revol-Junelles A M. Purification and characterization of halo-alkali-thermophilic protease fromHalobacteriumsp. strain HP25 isolated from raw salt,Lake Qarun,Fayoum,Egypt[J]. Extremophiles,2015,19(4):763-774.

[6]石万良,钟传奇,唐兵,等. 极端嗜盐古生菌(Natrinemasp.)R6-5胞外嗜盐蛋白酶的纯化和性质研究[J]. 微生物学报,2007,47(1):161-163.

[7]高瑞昌,刘向东,陆文婷,等. 嗜盐古生菌HalogranumrubrumRO2-11胞外蛋白酶酶学特性研究[J]. 现代食品科技,2015,31(2):32-36.

[8]Cui H L,Zhou P J,Oren A,et al. Intraspecific polymorphism of 16S rRNA genes in two halophilic archaeal genera,HaloarculaandHalomicrobium[J]. Extremophiles,2009,13:31-37.

[9]Minegishi H,Kamekura M,Itoh T,et al. Further refinement of the phylogeny of theHalobacteriaceaebased on the full-length RNA polymerase subunit B′(rpoB′)gene[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2010,60:2398-2408.

[10]中华人民共和国专业标准. ZB X 66030-87. 蛋白酶活力测定法[S].

[11]D’Alessandro C P,De Castro R E,Giménez M I,et al. Effect of nutritional conditions on extracellular protease production by the haloalkaliphilic archaeonNatrialbamagadii[J]. Letters in Applied Microbiology,2007,44:637-642.

[12]Reed C J,Lewis H,Trejo E,et al. Protein adaptations in archaeal extremophiles[J]. Archaea,2013,2013:1-14.

[13]Vidyasagar M,Prakash S,Litchfield C,et al. Purification and characterization of a thermostable,haloalkaliphilic extracellular serine protease from the extreme halophilic archaeonHalogeometricumborinquensestrain TSS101[J]. Archaea,2006,2(1):51-57.

[14]Studdert C A,Herrera Seitz M K,Plasencia Gil M I,et al. Purification and biochemical characterization of the haloalkaliphilic archaeonNatronococcusoccultusextracellular serine protease[J]. Journal of Basic Microbiology,2001,41(6):375-383.

[15]Zhou M Y,Chen X L,Zhao H L,et al. Diversity of both the cultivable protease-producing bacteria and their extracellular proteases in the sediments of the South China sea[J]. Microbial Ecology,2009,58:582-590.

[16]De Castro R E,Maupin-Furlow J A,Giménez M I,et al. Haloarchaeal proteases and proteolytic systems[J]. Fems Microbiology Reviews,2006,30:17-35.

IdentificationofhalophilicarchaeaproducingproteasefromYipinglangsaltmineanditsenzymaticproperties

HOUJing,XUJia-qi,LIYang,ZHOUYao,CUIHeng-lin*

(School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China)

Haloarchaeal strains isolated from Yipinglang salt mine were screened for extracellular protease production. Their enzyme properties were studied. The results showed that YPL20 and YPL26 showed the highest protease activity,and were identified asHalococcussalifodinaestrains. The maximal protease activity of YPL20 occurred at 50 ℃,pH9.0,and 0 mol/L NaCl. The YPL26 protease exhibited optimal activity at 50 ℃,pH7.0～9.0,and 2.5 mol/L NaCl. The YPL20 and YPL26 proteases were highly stable over wide ranges of temperatures,pH values and NaCl concentrations. Mn2+and Ca2+significantly enhanced protease activity of YPL20 and YPL26. Cu2+and Zn2+significantly inhibited the protease activities. The protease activities were completely inhibited by serine protease inhibitor,indicating that YPL20 and YPL26 proteases may be serine proteases.

extracellular protease;halophilic archaea;enzyme properties;Halococcussalifodinae

2017-06-13

侯靖(1988-)，女，博士，讲师，研究方向：食品微生物资源，E-mail：houjing@ujs.edu.cn。

*通讯作者:崔恒林(1970-)，男，博士，教授，研究方向：食品微生物多样性与安全性，E-mail：cuihenglin@ujs.edu.cn。

国家自然科学基金(31600002)；中国博士后科学基金(2015M581728)；江苏省博士后科研资助计划(1501069C)；江苏大学高级人才科研启动基金(15JDG062)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)23-0124-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.025