苯乳酸与单增李斯特菌和大肠杆菌胞内外基因组的抑菌作用机制

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(锦州医科大学食品科学与工程学院,辽宁锦州 121000)

苯乳酸与单增李斯特菌和大肠杆菌胞内外基因组的抑菌作用机制

吴汉东,黄云坡,金嫘,查恩辉,孙晶,周铭懿

(锦州医科大学食品科学与工程学院,辽宁锦州 121000)

为研究苯乳酸与食源性致病菌基因组的相互作用机制,选取单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes10403s)和大肠杆菌(E.coli44752)采用凝胶电泳阻滞实验法和紫外-可见光谱法研究苯乳酸与胞内、胞外基因组DNA的作用机制。实验结果表明苯乳酸与单增李斯特菌和大肠杆菌的胞内DNA迁移率和条带亮度均未发生变化,无相互作用;苯乳酸对单增李斯特菌和大肠杆菌的胞外DNA发生结合作用。单增李斯特菌体外DNA在苯乳酸16～32 mmol/L浓度下,与苯乳酸发生结合作用，结合常数为9.16×105M-1；大肠杆菌体外DNA在苯乳酸2～16 mmol/L的浓度下,与苯乳酸发生结合作用,结合常数为7.36×105M-1。两者的结合方式为静电结合和嵌插结合。

苯乳酸,食源性致病菌,紫外光谱,结合作用

苯乳酸(phenyllactic acid,PLA),也称β-苯乳酸或3-苯基乳酸,可以从蜂蜜和发酵食品中分离得到,是一种新型天然防腐剂[1-3]。2000年,Lavermicocca[4]等人从乳酸菌属Lactobacillusplantarum21B代谢产物中分离得到苯乳酸,研究发现苯乳酸具有抑菌谱广、水溶性好、易扩散和来源广泛等天然优势,被认为是继从乳酸菌分离的第一代抑菌物质乳酸、醋酸,第二代抑菌物质如Nisin等细菌素之后,可用于食品体系的新型抑菌物质[2,4]。因此研究其抑菌机理为其更好的开发和应用打下理论基础。

天然防腐剂是食品安全研究领域的热点之一,具有高效、广谱、安全等优点,在未来食品防腐剂中有很高的应用前景。抑菌机理是研究和开发新型天然防腐剂的理论基础。当前抑菌机制的研究主要集中在细胞壁、细胞膜和酶系统,各种抑菌物质的抑菌机理各有不同[2]。苯乳酸是近年来发现的潜在防腐剂,早在1998年Dieuleveux[5]等就发现苯乳酸的抑菌靶位之一细胞壁,时隔十年2009年孟祥晨[1]课题组得到同样的结论：细胞壁是苯乳酸的抑菌靶位。那么苯乳酸是否对核酸产生作用,细胞壁是否是苯乳酸的唯一作用位点,目前对此相关报道还很少,因此本文通过研究苯乳酸与食源性致病菌中单增李斯特菌(革兰氏阳性菌:Listeriamonocytogenes10403s)和大肠杆菌(革兰氏阴性菌:E.coli44752)基因组胞内和胞外的作用方式探究苯乳酸对核酸的作用机制,为进一步研究苯乳酸与食源性致病菌的抑菌机理打下理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

苯乳酸(D-PLA) Sigma公司;单增李斯特菌(L.monocytogenes10403s),大肠杆菌(E.coli44752) 河北科技大学食品生物技术与安全实验室保藏；细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型,DP302),缓冲液GA、GB、GD及漂洗液PW为产品成分简称;其他所用化学试剂 均为国产分析纯。

梅特勒-托利多 上海有限公司:EL204分析天平 上海精密仪器有限公司:PHS-3C pH计 美国Bio-rad公司:170-4405EDU琼脂糖水平电泳仪 美国Thermo公司:Evolution 220紫外分光光度计 美国Wealtec公司:Dolphin-DOC凝胶成像系统。

1.2 实验方法

1.2.1 苯乳酸与细菌DNA的凝胶阻滞实验

1.2.1.1 基因组DNA的提取 采用CTAB提取法提取食源性致病菌的DNA[6-7],步骤如下:

吸取1.5 mL对数期细菌溶液注入离心管中,8000 r/min离心5 min。

向沉淀中加入200 μL GA或者对于单增用溶菌酶进行破壁处理,具体方法为:加入180 μL缓冲液(20 mmol/L Tris,pH8.0,2 mmol/L Na2-EDTA,1.2% Triton);终浓度为20 mg/mL的溶菌酶(溶菌酶必须用溶菌酶干粉溶解在缓冲液中进行配制),37 ℃处理30 min以上。

加入4 μL RNaseA(100 mg/mL)溶液,振荡15 s,室温放置5 min。

向管中加入20 μL蛋白酶K,混匀;加入220 μL GB,于70 ℃水浴中静置10 min,离心30 s。

加入220 μL无水乙醇,8000 r/min离心30 s除去管盖内壁的水珠。

将上一步所得的溶液和沉淀都加入到套有收集管的吸附柱CB3中,12000 r/min离心30 s,弃掉液体,将吸附柱子CB3放回收集管中;向CB3中加500 μL的GD,12000 r/min离心30 s,弃掉液体,将吸附柱子CB3放回收集管中;向CB3中加700 μL的PW,12000 r/min离心30 s,弃掉液体,将吸附柱子CB3放回收集管中;向CB3中加500 μL的漂洗液PW,12000 r/min离心30 s,弃掉液体,将吸附柱子CB3放回收集管中;紫外检测DNA溶液的浓度,OD260值为l相当于大约50 pg/mL双链DNA,OD260/OD280比值应为1.7～1.9。

1.2.1.2 凝胶电泳法测定 苯乳酸与胞外食源性致病菌基因组DNA的相互作用 凝胶的制备:采用1%琼脂糖(内加2 μL EB/10 mL胶,0.5 μg/mL溴化乙锭)(琼脂糖的浓度跟分子量大小有关,根据单增DNA的分子量可以采用0.5%～1.0%琼脂糖凝胶电泳)。0.5 g琼脂糖溶于50 mL TAE中,加热,搅拌均匀,倒板前先插好电泳槽和梳子,30 min左右晾干后点样。

制样:将苯乳酸与DNA溶液等体积混合得到相同DNA浓度下,苯乳酸浓度分别为1～32 mmol/L的终浓度作用0.5 h。

上样:DNA混合物样品中加入loading buffer,混匀后,加入到样品孔中。点样量为10 μL一个孔即可。

电泳:电泳压力为95 V,时间为40 min。

成像:用凝胶成像分析系统记录电泳结果。

分析:将凝胶成像系统拍下的图像进行分析。

1.2.2 苯乳酸与食源性致病菌胞内DNA的凝胶电泳实验 先将苯乳酸配成浓度为1、2、4、8、16 mmol/L的溶液,在该浓度下与革兰氏阳性菌(L.monocytogenes10403s)革兰氏阴性菌(E.coli44752)菌悬液相互作用1 h(菌体生长的延滞期),菌悬液浓度为1×108CFU/mL,作用条件为37 ℃恒温箱中培养。将混合液离心,弃掉上清,用磷酸缓冲液悬起,采用CTAB法提取菌体DNA,进行凝胶电泳,成像分析,方法见1.2.1。

1.2.3 紫外光谱法测定苯乳酸与DNA的相互作用方式

1.2.3.1 苯乳酸紫外光谱检出限的测定 采用紫外分光光度计(Evolution 220)紫外扫描测定不同浓度的苯乳酸溶液图谱。波长范围200～350 nm。

1.2.3.2 苯乳酸与DNA相互作用的紫外光谱法测定 不同浓度的PLA(0.25、0.5、1 mg/mL)与DNA(126.2 μmol/L)等体积混合后,在37 ℃下相互作用30 min,然后采用紫外光谱扫描法分析混合体系在200～350 nm下的紫外光谱;选取2.5 mg/mL浓度的PLA与DNA(126.2 μmol/L)等体积混合后,分别相互作用15、30、45 min、1、2、3 h后,同样的扫描条件分析200～350 nm下的紫外光谱变化。

1.2.4 苯乳酸与DNA相互作用的紫外结合常数的计算 紫外吸收下的结合常数Kb是确定结合稳定性的一个指标,结合常数越大,表示结合越稳定,结合公式为:

式(1)

式(1)中,C:溶液中DNA的浓度(μmol/L);εα:结合状态下DNA的摩尔吸光系数;εb:该浓度吸光值与抑菌剂的浓度的比值;εf:自由状态下DNA的摩尔吸光系数;Kb:紫外的结合常数(M-1)[8-9]。

1.2.5 数据处理 每份样品重复测定3次,取其平均值。以Origin(Origin Pro.8.0)作图软件对实验数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 苯乳酸与基因组DNA的凝胶电泳实验

2.1.1 苯乳酸与体外基因组的凝胶电泳实验 不同浓度的苯乳酸对一定浓度的L.monocytogenes10403s和E.coli44752的体外DNA的凝胶电泳成像结果见图1和图2。凝胶电泳实验中,迁移率是否改变说明PLA是否与DNA发生作用,相对分子质量影响迁移率,迁移率的改变与相对分子质量成反比[10],苯乳酸在16、32 mmol/L浓度下,L.monocytogenes10403s DNA条带的迁移率与对照组相比有明显的降低,亮度与对照组相比增加,相对分子质量有所增加,荧光强度有增加;苯乳酸在2～16 mmol/L浓度下,E.coli44752 DNA条带的迁移率与对照组相比有明显的降低,亮度与对照组相比随着浓度的增加而增加。苯乳酸与体外DNA产生了一定的结合作用,并且随着浓度的增加而结合作用越明显。

图1 苯乳酸与L. monocytogenes 10403s基因组体外作用后的凝胶电泳图像Fig.1 Gel electrophoresis of PLA with different concentration interact with L. monocytogenes 10403s DNA in vitro注:从左至右,数字分别代表空白、32、16、8、4、2、1 mmol/L的苯乳酸与63.2 μmol/L DNA相互作用1 h。

图2 苯乳酸与E. coli 44752基因组体外作用后的凝胶电泳图Fig.2 Gel electrophoresis of PLA with different concentration interact with E. coli 44752 DNA in vitro注:从左到右,数字分别代表空白、1、2、4、8、16、32 mmol/L的苯乳酸与63.2 μmol/L DNA相互作用1 h。

2.1.2 苯乳酸与体内DNA的相互作用实验分析 不同浓度的苯乳酸对一定浓度的L.monocytogenes10403s和E.coli44752菌体的体内DNA凝胶电泳成像结果见图3和图4。可以看出,实验组2～6与对照组1相比较,条带的迁移率和亮度均无明显变化,说明苯乳酸在与L.monocytogenes10403s和E.coli44752 菌体发生抑菌作用时,并未与体内DNA发生直接作用。前人研究苯乳酸能够破坏单增李斯特菌的细胞壁[1],本实验佐证了苯乳酸的抑菌机理与体内DNA无直接关系,完善了苯乳酸的抑菌作用机理。

图3 苯乳酸与L. monocytogenes 10403s作用后提取DNA的凝胶电泳图像Fig.3 Gel electrophoresis of PLA with different concentration interact with L. monocytogenes 10403s DNA注:1～6分别代表空白、1、2、4、8、16 mmol/L的苯乳酸与63.2 μmol/L DNA相互作用1 h。

图4 苯乳酸与E. coli 44752作用后提取DNA的凝胶电泳图Fig.4 Gel electrophoresis of PLA with different concentration interact with E.coli 44752 DNA注:1代表空白,2～6分别1、2、4、8、16 mmol/L的苯乳酸与63.2 μmol/L DNA相互作用1 h。

2.2 紫外分光光度法分析苯乳酸与单增李斯特菌和大肠杆菌基因组的结合方式

苯乳酸具有苯环的有机酸小分子,通过紫外的全波长扫描发现苯乳酸具有紫外吸收,如图5所示。苯乳酸的紫外检出限为10 μg/mL～10 mg/mL,峰值在257.1 nm处。

图5 不同浓度的苯乳酸紫外分光光度计扫描光谱Fig.5 The ultravlolet spectrophotometer scanning spectrum by different concentrations of PLA 注:箭头所指方向为苯乳酸浓度逐渐增加。

图6 苯乳酸与L. monocytogenes 10403s DNA相互作用后的紫外光谱扫描Fig.6 UV spectroscopy scanning after PLA interact with L. monocytogenes 10403s DNA注:右上角图为苯乳酸与DNA相互作用的结合常数；图7同。

如图6紫外光谱图所示,DNA浓度不变的情况下,随着苯乳酸含量的增加,260.0 nm处的紫外吸收值增加,产生增色效应,且峰值由260.0 nm微移动到257.8 nm处,有2.2 nm的蓝移。

紫外结合常数的计算,如图6、图7中右上角的直线图,采用式(1),通过不同浓度的DNA与一定浓度苯乳酸作用后,取其峰值吸光度值,计算得到C/(εα-εb)与C的线性关系,其斜率即为小分子物质与DNA的紫外结合常数,该结合常数一般在1×105～1×107之间,常数越大表示结合越稳定[8-9]。图6为苯乳酸与L.monocytogenes10403s基因组的紫外光谱图,其结合常数为9.16×105M-1。图7为苯乳酸与E.coli4752基因组的紫外光谱图,其结合常数计算为7.36×105M-1。

图7 苯乳酸与E. coli 4752 DNA相互作用后的紫外光谱扫描Fig.7 UV spectroscopy scanning after PLA interact with E. coli 4752 DNA

3 讨论

早在1992年,Yonezawa等人从鲎中提取一种天然抗菌肽tachyplesin对DNA发生结合作用[10];2013年,李莉蓉等人发现天然抗菌肽ppTG20衍生的P7对DNA也有结合作用[11]。本实验从凝胶电泳结果中发现苯乳酸对DNA发生了作用从而使核酸的迁移率较对照组降低,这与MDpep9[12],茶多酚[13],天然多糖[14]和蜂蜜中的多酚提取物[15]与DNA作用的结果是一致的,值得注意的是,苯乳酸的酸性很强,在体外实验中,32 mmol/L的浓度下,E.coli44752 DNA发生了完全降解,推测是低pH对核酸的降解具有辅助作用。通过凝胶电泳的结果我们很难判断DNA与苯乳酸的结合方式,为了深入探讨,我们采用了紫外光谱法来分析,发现苯乳酸与DNA 作用发生了增色效应和微小的蓝移(260.0～257.8 nm),这与彭俊峰等人[16]的研究是一致的,根据Long理论,增色效应是该物质与DNA发生嵌插作用的标志,是小分子与DNA碱基相互作用的结果[17-19]。Muhammad Sirajuddin通过公式得到结合常数,客观的提供小分子物质与DNA的结合能力判断[20-21]。苯乳酸与DNA不仅发生了结合,且结合方式为静电和嵌插结合,并可能伴随着范德华力。

目前虽然已开发出了数十种天然食品抑菌剂,但是对食品抑菌剂的抑菌机理仍缺乏系统完整的理论基础,需要分子生物学,医药化工等多门学科做指导。目前研究防腐剂的抑菌机理大多在细胞壁、细胞膜、酶系统、能量供应和抑制核酸合成等方面[22-24],研究其与核酸的相互作用是补充和完善抑菌机制的重要环节。

4 结论

苯乳酸对L.monocytogenes10403s体外DNA发生一定的结合作用,苯乳酸浓度16～32 mmol/L迁移率降低,随着苯乳酸浓度的增加,条带亮度有增加;苯乳酸对E.coli4752体外DNA发生一定的结合作用,苯乳酸浓度2～16 mmol/L迁移率降低,亮度随着苯乳酸浓度的增加而增加。不同浓度的苯乳酸对L.monocytogenes10403s和E.coli4752菌体的体内DNA均未发生相互作用,凝胶电泳的条带迁移率和明亮度与对照组一致。

紫外光谱法发现苯乳酸作用L.monocytogenes10403s和E.coli44752的DNA发生增色效应和微小的蓝移(260.0 nm移动到257.8 nm),即苯乳酸与DNA发生了结合作用,结合方式为静电结合和嵌插结合。得到苯乳酸与DNA的结合常数:苯乳酸与L.monocytogenes10403s基因组的结合常数为9.16×105M-1;苯乳酸与和E.coli44752基因组结合常数为7.36×105M-1。

[1]袁景环,贡汉生,孟祥晨.苯乳酸的抗菌作用及其抗菌机理的初步研究[J]. 食品工业,2009(5):14-17.

[2]李兴峰. 乳杆菌生物合成苯乳酸的研究[D].无锡:江南大学,2008.

[3]Ryan LAM,Bello FD,Czerny M,et al.Quantification of Phenyllactic Acid in Wheat Sourdough Using High Resolution Gas Chromatography-Mass Spectrometry[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2009,57(3):1060-1064.

[4]Lavermicocca P,Valerio F,Evidente A,et al.Purification and Characterization of Novel Antifungal Compounds from the SourdoughLactobacillusplantarumStrain 21B[J]. Applied and Environmental Microbiology,2000,66(9):4084-4090.

[5]Dieuleveux V,Gueguen M. Antimicrobial Effects of D-3-Phenyllactic Acid on Listeria Monocytogenes in Tsb-Ye Medium,Milk,and Cheese[J]. Journal of Food Protection,1998,61(10):1281-1285.

[6]汪莉君,邵华. DNA加合物检测技术研究进展[J]. 中国公共卫生,2008(2):187-188.

[7]汪莉君. DNA化学损伤机制模式的研究[D].济南:山东省医学科学院,2008.

[8]Dey S,Sarkar S,Paul H,et al.Copper(II)complex with tridentate N donor ligand:Synthesis,crystal structure,reactivity and DNA binding study[J]. Polyhedron,2010,29(6):1583-1587.

[9]Selim M,Chowdhury S R,Mukherjea K K.DNA binding and nuclease activity of a one-dimensional heterometallic nitrosyl complex[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2007,41(5):579-583.

[10]王镜岩. 生物化学[M].北京:高等教育出版社,2008.

[11]Brogden K A,Antimicrobial peptides:pore formers or metabolic inhibitors in bacteria?[J]. Nat Rev Micro,2005,3(3):238-250.

[12]Li LR,Shi YL,Le GW. Antibacterial activity and mechanisms of a new peptide derived from cell-penetrating peptide][J]. Wei sheng wu xue bao. Acta microbiologica Sinica,2013,53(9):950-956.

[13]Tang YL,Shi YH,Zhao W,et al.Interaction of MDpep9,a novel antimicrobial peptide from Chinese traditional edible larvae of housefly,withEscherichiacoligenomic DNA[J]. Food Chemistry,2009,115(3):867-872.

[14]钱丽红,陶妍,谢晶. 茶多酚对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抑菌机理[J]. 微生物学通报,2010(11):1628-1633.

[15]He F,Yang Y,Yang G,et al. Studies on antibacterial activity and antibacterial mechanism of a novel polysaccharide fromStreptomycesvirginiaH03[J]. Food Control,2010,21(9):1257-1262.

[16]Brudzynski K,Abubaker K,Miotto D. Unraveling a mechanism of honey antibacterial action:Polyphenol/H2O2-induced oxidative effect on bacterial cell growth and on DNA degradation[J]. Food Chemistry,2012,133(2):329-336.

[17]彭俊峰,凌建亚,张晗星,等. 虫草素与DNA作用的光谱研究[J]. 光谱学与光谱分析,2004(7):858-861.

[18]Huang R,Wang LR,Guo LH. Highly sensitive electrochemiluminescence displacement method for the study of DNA/small molecule binding interactions[J]. Analytica Chimica Acta,2010,676(1-2):41-45.

[19]Rauf S,Gooding JJ,Akhtar K,et al. Electrochemical approach of anticancer drugs-DNA interaction[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2005,37(2):205-217.

[20]李兴峰,黄云坡,王志新,等. DNA:天然防腐剂抑菌作用的新靶位[J]. 中国食品学报,2015(4):130-135.

[21]Sirajuddin M,Ali S,Badshah A. Drug-DNA interactions and their study by UV-Visible,fluorescence spectroscopies and cyclic voltametry[J]. Journal of Photochemistry and Photobiology B:Biology,2013,124(0):1-19.

[22]李兴峰,江波,潘蓓蕾,等. 产苯乳酸的乳酸菌分离筛选及菌种鉴定[J]. 食品与发酵工业,2007(2):1-4.

[23]Sikdar S,Mukherjee A,Ghosh S,et al. Condurango glycoside-rich components stimulate DNA damage-induced cell cycle arrest and ROS-mediated caspase-3 dependent apoptosis through inhibition of cell-proliferation in lung cancer,invitroandinvivo[J]. Environmental Toxicology and Pharmacology,2014,37(1):300-314.

[24]Lakshmipraba J,Arunachalam S,Riyasdeen A,et al.DNA/RNA binding and anticancer/antimicrobial activities of polymer-copper(II)complexes[J]. Spectrochimica Acta Part A:Molecular and Biomolecular Spectroscopy,2013,109(0):23-31.

[25]Ashwini Kumar K,Reddy KL,Vidhisha S,et al. Synthesis,characterization and DNA binding and photocleavage studies of[Ru(bpy)2BDPPZ]2+,[Ru(dmb)2BDPPZ]2+and[Ru(phen)2BDPPZ]2+complexes and their antimicrobial activity[J]. Applied Organometallic Chemistry,2009,23(10):409-420.

ThebacteriostaticmechanismofphenyllacticacidwithListeriamonocytogenesandEscherichiacoligenomeDNA

WUHan-dong,HUANGYun-po,JINLei,ZHAEn-hui,SUNJing,ZHOUMing-yi

(College of Food Science and Engineering,Jinzhou Medical University,Jinzhou 121000,China)

The interaction between phenyllactic acid(PLA)and Foodborne pathogenic bacteria genome(Listeriamonocytogenes10403s andE.coli44752)invivo/vitrowas studied by agarose gel electrophoresis and UV spectra. The results showed that there was no apparent interaction between PLA and the intracellular DNA ofListeriamonocytogenes10403s andE.coli44752. The absorption UV spectra demonstrated that PLA could interact with bacterial genomic DNAinvitroin the manner of intercalation and groove binding. The binding constant K of PLA(16～32 mmol/L)was 9.16×105M-1forListeriamonocytogenes10403s and the binding constant of PLA(2～16 mmol/L)K=7.36×105M-1forE.coli44752.The combination of PLA with DNAinvitrodemonstrated that was static interaction and intercalation.

phenyllactic acid;foodborne pathogenic bacteria genome;ultraviolet spectrum;fluorescence spectrum;interaction

2017-03-22

吴汉东(1975-)，男，硕士，副教授，研究方向：动物性产品精深加工技术，E-mail:whd9518@163.com。

TS201.3

A

1002-0306(2017)23-0110-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.022