骨形态发生蛋白-2在肝包虫外囊壁钙化中的作用

杨婧 ，张宏伟 ，葛权虎 ，赵伯文 ，彭心宇 ，张示杰 ，孙红 ，吴向未 ，郭淑霞 *

（1石河子大学医学院第一附属医院，新疆 石河子 832002；2石河子大学医学院预防医学系，新疆 石河子 832002）

骨形态发生蛋白-2在肝包虫外囊壁钙化中的作用

杨婧1，张宏伟1，葛权虎1，赵伯文1，彭心宇1，张示杰1，孙红1，吴向未1，郭淑霞2*

（1石河子大学医学院第一附属医院，新疆 石河子 832002；2石河子大学医学院预防医学系，新疆 石河子 832002）

为探讨骨形态发生蛋白-2(BMP-2)在囊型包虫外囊壁钙化中所起的作用。采用分离肝包虫囊肿囊壁细胞并诱导其向成骨分化的方法，同时成骨培养基中添加不同浓度的重组人源BMP-2（rh BMP-2）和抑制剂并诱导细胞成骨分化，茜素红染色评估囊壁细胞成骨分化能力；通过观察囊肿情况和对囊壁组织行免疫组化，评估BMP-2因子对囊壁钙化的影响。结果显示，成骨诱导后，囊壁细胞矿化结节增多，外源性的rh BMP-2可促进囊壁细胞矿化，而抑制剂却抑制了这种效果。在肝包虫的动物模型中，抑制剂抑制囊壁细胞的钙化，使得囊肿变小、虫体活力减低。由此可知，包虫囊肿囊壁细胞具有成骨分化潜能，体外成骨诱导可获得成骨细胞样表型；BMP-2促进包虫囊肿囊壁细胞钙化；药理学调控作用下的囊壁钙化将成为包虫病新的治疗靶点。

包虫外囊壁；钙化；BMP-2

包虫病是由细粒棘球蚴绦虫引起人畜共患寄生虫病，肝脏是最常受累的器官[1]，肝包虫病主要流行于我国西北及西南等地。临床中发现大多数包虫囊肿外囊壁会发生钙化，且常伴有囊肿内容物的退化以及囊肿尺寸的缩减，生物学上称之为“非活跃期”，临床称之为“静止性病变”，当囊壁钙化情况加重，虫体则大量死亡，这是因为囊壁大范围的钙化使得虫体从周围组织摄取营养变的更难[2-3]。因此，从药理学方面调控囊壁的钙化可能成为这类疾病新的治疗靶点，但是目前外囊壁钙化的发生发展机制，目前尚不明确。

骨形态发生蛋白 (bone morphogenetic protein，BMP)是一种由细胞分泌的、具有异位成骨能力的生长因子，因其能够参与间充质干细胞成骨分化，目前被广泛运用于骨折愈合、生物工程和再生医学领域[4-5]。先前，已有学者提出在包虫外囊壁组织表达转化生长因子β（TGF-β）[3]，那么作为TGF-β超家族成员，BMP是否参与了包虫外囊壁的钙化过程，是否对于包虫囊壁的钙化起到影响作用？本研究我们将通过外囊壁细胞培养以及建立肝包虫动物模型来探讨BMP-2在囊壁钙化中发挥的生物学作用。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物：2个月大的免疫缺陷C57BL/6小鼠购自新疆医科大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK(新)2011-0003，在SPF级实验动物房饲养，其饲养设施合格证号为SYxK(新)2011-0001)。包虫病羊肝：购置于昌吉屠宰场。

实验试剂：α-MEM培养基购置于美国Gibco公司，青霉素、硫酸链霉素、10%胎牛血清（FBS）购置美国Hyclone公司，重组人源BMP-2购置美国RD公司，地塞米松、β-甘油磷酸、抗坏血酸-2-磷酸、SB203580、茜素红均购置于美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 肝包虫囊肿的囊壁细胞（HPCs）

获得CE患者知情同意后，在病人行肝包虫外囊摘除术的同时收集囊壁组织，并通过胶原酶消化法分离培养囊壁细胞，细胞培养在α-MEM基础培养基中，培养基中含青霉素（100 U/mL），硫酸链霉素（100 μg/mL）以及 10%FBS，细胞放于 37 ℃、5%CO2的培养箱中进行培养。细胞培养72 h后，去除没有贴壁的细胞，并用PBS轻柔的洗涤2次，换上新鲜的培养液。以后每2 d换一次液，约生长至80%～90%底面积后按1∶2比例传代。人骨髓间充质干细胞（BMSCs）和人皮肤成纤维细胞（DFBs）由曹旭教授（美国约翰霍普金斯大学整形外科）提供。

1.2.2 HPCs体外成骨分化实验

HPCs接种在含10%FBS、地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸、5 μmol/L抗坏血酸 -2-磷酸的α-MEM培养基中，细胞接种密度为5×103/cm2，以含10%FBS的α-MEM培养基作为阴性对照。细胞诱导分化21 d后，茜素红染色。

1.2.3 肝脏包虫实验模型的建立

通过无菌方法从感染细粒棘球蚴病羊肝的囊泡中获取包虫囊液，通过虫体移动度以及HE染色后光镜下观察鉴定虫体活性。盐酸氯胺酮（50 mg/kg）麻醉小鼠，行中线开腹手术，肝被膜下种植0.2 mL浓度相同的原头蚴沉积物。

1.2.4 B MP-2干预

待建模2月后，使用30 mg/kg的重组BMP-2因子腹腔注射，连续注射7周后，观察囊肿钙化情况。

1.2.5 免疫组化

小鼠安乐死后，中线剖腹行肝切除，10% 的甲醛固定48 h，石蜡包埋，切片（厚为4 μm），茜素红染色，光镜下观察。

1.2.6 统计学方法

应用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量资料以X±S表示，两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方法分析（ANOVA），P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 分离出的HPCs获得了成骨样细胞表型

HPCs、BMSCs和DFBs成骨分化能力的鉴定。3种细胞成骨诱导培养21 d茜素红染色。结果表明：在BMSC组和HPCs组，成骨样矿化结节均较对照组显著增加，这两组矿化结节的表达水平几乎相当，然而DFBs组矿化结节的表达水平却非常低（图1）。

图1 肝包虫病囊外肿囊壁细胞成骨潜能Fig.1 Osteogenic potential of cells within pericysts of CE

2.2 BMP-2促进细胞矿化

为了评估BMP-2对于HPCs成骨分化能力，HPCs 培 养 在 添 加 有 不 同 浓 度（0、100、200、400 ng/mL）BMP-2 以及不同浓度（10、20、30、40 μmol/L）BMP-2抑制剂SB203580的成骨诱导培养基中，结果表明：BMP-2促进了成骨样矿化结节的形成，浓度越高矿化结节越明显，然而SB203580抑制了矿化结节的形成，浓度越高矿化结节越稀少，且二者的变化均成浓度依赖性（图2）。

图2 体外BMP-2蛋白对囊壁细胞矿化的影响Fig.2 Effect of modulating BMP-2 signaling on mineralization of HPCs in vitro

2.3 体内实验，使用BMP-2促进囊壁的钙化

为了解体内BMP-2对包虫囊肿生长的影响，通过肠系膜静脉，将原头节注射至免疫缺陷小鼠腹腔内，在原头节注射2个月后，小鼠腹腔注射相同剂量的BMP-2因子，7周后观察包虫的生长情况。结果表明：对照组30只小鼠中，有21只小鼠可见稍大的囊泡。对照组包虫囊肿，体积较大，较明亮，钙化不明显（图3a）；BMP-2组中，有19只小鼠可见稍小的、乳白色的钙化斑点，未见液性的囊泡。BMP-2组，包虫囊肿体积较小，乳白色，钙化明显（图3b）。

图3 BMP-2体内对包虫囊肿的作用Fig.3 Effect of BMP-2 on mineralization of the pericyst wall in vivo

囊肿切除后，茜素红染色，光镜下观察。结果表明：在正常生长的囊肿外囊壁，可见少量的矿化沉积。光镜下观察，对照组茜素红染色，提示红色矿化带不明显（图3c）；BMP-2处理后，可见大量的囊肿囊壁矿化沉积。光镜下观察，BMP-2组茜素红染色，提示红色矿化带明显（图3d）。以上表明BMP-2可促进包虫的囊壁钙化。

3 讨论

目前，尽管存在很多种治疗肝包虫病的方法，但外科手术仍然是首选治疗方案，外科手术有多种术式可被选择，这些术式的基本原则均是根除囊肿以及通过控制囊肿破溃降低复发率[6-8]。对于那些因为年龄、复合病变以及囊肿生长位置不佳等因素而不能行外科手术的患者，抗包虫药物的治疗也能取得一定的效果[9-10]。当前包虫病治疗的药理靶点是抗寄生虫，因为寄生虫妨碍了葡萄糖的吸收，导致患者糖原耗竭以及线粒体和内质网发生一系列退变[11]。过去的几十年里，许多化疗药物已成为主要的或者辅助的方案用于抗寄生虫治疗[12]，目前运用较为广泛的药物包括甲苯达唑、阿苯达唑[13]。虽然口服这些药物能够维持一定的血浆浓度，但囊肿穿刺对于临床医生来讲仍有一定难度，因此迫切需要寻找新的抗包虫治疗靶点。

本研究发现，包虫病囊肿囊壁细胞具有成骨潜能，BMP-2促进囊壁细胞的矿化和成骨成熟。研究发现BMP-2是参与骨分化的重要调节者，邹学军等[14]发现人重组BMP-2诱导小鼠BMSCs细胞7 d后，成骨分化明显。BMP-2活性多肽能有效地促进OPG-/-小鼠BMSCs向成骨方向分化，其诱导作用存在剂量依赖关系[15]。邵云峰等[16]研究发现经腺病毒介导的人BMP-2基因转染的脂肪间充质干细胞在体外诱导培养中可以向成骨细胞定向分化，并保持较强的增殖能力。研究表明BMP-2可能是通过与其不同的两种受体（I型和II型）结合形成异二聚体，诱导Smads信号转导途径，或通过Smad信号通路依赖的丝裂原活化蛋白激酶（ERK、JNK、p38MAPKs）发挥其生物学作用[17]。孙欣等[18]通过加入BMP-2及相应阻断剂观察BMP-2和p38丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)在BMSC向成骨细胞分化中的作用，发现BMP-2组BMSC中ALP活性和钙沉积量增加，阻断剂组表达明显延迟，提示BMP-2可通过p38MAPK通路促进BMSC向成骨细胞分化。以上研究均提示BMP-2在骨分化过程中扮演着重要角色。我们的研究发现肝包虫囊肿囊壁细胞在成骨诱导培养基中诱导后具有成骨细胞样表型，提示囊壁细胞具有成骨潜能，并且在体内外，BMP-2促进囊壁细胞成骨分化。

大多数寄生囊肿囊壁会有钙化，且常伴有囊肿内容物和囊肿大小的退行性变，寄生虫压迫改变了其周围组织血管的生长环境；同时，炎性细胞浸润、纤维化和外膜钙化引起的坏死灶有关，外膜钙化使得虫体摄取营养变得更加困难，甚至还可能导致虫体死亡，这也加剧了这一情况[2-3]。本研究最重要的发现是BMP-2促进包虫囊壁的钙化，而囊壁的钙化直接关系到囊肿的发展状态以及虫体的活性。我们重点观察了BMP-2对囊肿生长的局部疗效，尽管BMP-2对全身反应的影响目前尚无定论，但对于包虫病病人而言，BMP-2确实是一个比较有吸引力的治疗靶点，给这类患者抗包虫治疗带来了新的希望。

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Effect of bone morphogenetic protein BMP-2 on the calcification of hydatid cysts

Yang Jing1，Zhang Hongwei1，Ge Quanhu1，Zhao Bowen1，Peng Xinyu1，Zhang Shijie1，Sun Hong1，
Wu Xiangwei1，Guo Shuxia2*
(1 The First Affiliated Hospital of the Medical College,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832003,China;2 Department of Preventive Medicine,School of Medicine,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832002,China)

Objective to evaluate the effect of modulating BMP-2 signaling on the calcification of hydatid pericyst.Methods Pericyst cells were isolated from hepatic hydatid cysts.These cells were cultured with osteogenic media and were evaluated for mineralization capacity using Alizarin Red staining.Cells were also treated with different doses of recombinant human BMP-2 and BMP-2 inhibitor,and the mineralization capacity were analyzed using Alizarin Red staining.The effects of inhibiting BMP-2 signaling on calcification ofpericystwallswere evaluated through insightinto hydatid cyststhemselvesand immunohistochemical analysis.Results Cells within the pericyst showed high levels of mineralized nodule formation,as induced by osteogenic media.These effect could be intensified by adding recombinant human BMP-2 (rh BMP-2)and inhibited by BMP-2 inhibitor. In the animal model of cystic echinococcosis,inhibition of BMP-2 signaling decreased calcification of the pericyst wall,which was associated with decreased cysts and lower viability of protoscoleces.Conclusion Cells within the pericysts acquire an osteoblast-like phenotype and have osteogenic potential.BMP-2 increases hydatid cyst calcification.Pharmacological mediation of calcification in pericysts may lead to new strategies for therapeutic intervention of hydatid disease.

Hydatid pericyst；Calcification；BMP-2

R562

A

10.13880/j.cnki.65-1174/n.2017.05.008

1007-7383(2017)05-0570-04

2017-03-29

国家自然科学基金项目（81360453，81260412）

杨婧（1987-）,女，硕士研究生，专业方向为医院管理。

*通信作者：郭淑霞（1962-），女，教授，从事流行病与卫生统计研究，e-mail：pge888@sina.com。