两性霉素B对人THP-1细胞产生肿瘤坏死因子α、白细胞介素8及p38MAPK活化的影响

叶雯霞 杜蕾蕾 段志敏 刘彩霞 李岷 高宇

325000温州医科大学附属第二医院皮肤科［叶雯霞（现在温州医科大学附属第六医院丽水市人民医院皮肤科，323000）、高宇］；中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病医院真菌科（杜蕾蕾、段志敏、刘彩霞、李岷）

两性霉素B对人THP-1细胞产生肿瘤坏死因子α、白细胞介素8及p38MAPK活化的影响

叶雯霞 杜蕾蕾 段志敏 刘彩霞 李岷 高宇

325000温州医科大学附属第二医院皮肤科［叶雯霞（现在温州医科大学附属第六医院丽水市人民医院皮肤科，323000）、高宇］；中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病医院真菌科（杜蕾蕾、段志敏、刘彩霞、李岷）

目的 探讨两性霉素B对人急性单核细胞白血病细胞系THP-1细胞系分泌肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素8（IL-8）以及p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）活化的影响。方法 将THP-1细胞分为空白对照组、两性霉素B组（分别加入2、4、8 mg/L两性霉素B处理）；阳性对照组（用100 μg/L β葡聚糖或者100 mg/L脂多糖处理）。实时荧光定量PCR分析不同刺激物和THP-1细胞作用一定时间后TNF-α、IL-8 mRNA表达水平。酶联免疫吸附试验检测8 mg/L两性霉素B刺激THP-1细胞24 h后上清液中TNF-α分泌量。Western印迹检测8 mg/L两性霉素B作用THP-1细胞后p38MAPK和磷酸化p38MAPK的水平。结果 2、4、8 mg/L两性霉素B刺激6 h，TNF-α mRNA水平分别为7.55±1.17、19.47±2.91、57.22±0.65，与空白对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.01、0.001、0.001）。IL-8 mRNA水平分别为2.98± 0.04、5.22±1.35、11.82±1.66，与空白对照组比较，差异均有统计学意义（P ＜ 0.01、0.001、0.001）。8 mg/L两性霉素B刺激THP-1细胞1、3、6 h后TNF-α mRNA水平分别为8.61±0.30、10.75±0.08、56.98±2.43，与空白对照组比较，差异均有统计学意义（P ＜0.05、0.01、0.001）。IL-8 mRNA水平分别为2.63±0.28、5.35±0.98、11.73±1.18，与空白对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05、0.01、0.001）。8 mg/L两性霉素B刺激THP-1细胞24 h上清液中TNF-α蛋白水平为（4 039.06±223.87）ng/L，与空白对照组比较差异有统计学意义（P＜0.001）。结论两性霉素B体外可促进人THP-1细胞p38MAPK蛋白磷酸化及TNF-α和IL-8分泌，具有免疫调节作用。

两性霉素B；肿瘤坏死因子α；白细胞介素8；p38丝裂原活化蛋白激酶类；单核细胞THP-1

两性霉素B是经典的多烯类抗真菌药物，抗菌谱广，可用于治疗念珠菌、曲霉、隐球菌引起的系统感染，是重症真菌感染治疗的基石［1］。近年研究显示，两性霉素B除了对真菌有直接杀灭作用外，还对宿主免疫系统具有调节作用［2-4］。本研究旨在探讨两性霉素B在调节固有免疫中的作用。

材料与方法

1.细胞和主要试剂：人单核细胞白血病细胞株（THP-1细胞株）来自美国模式培养物集存库（ATCC）。两性霉素B为美国Sigma公司产品，用二甲基亚砜（DMSO）配制成不同浓度待用。兔抗人p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、磷酸化p38 MAPK抗体（美国Cell Signaling Technology公司），iTaq Universal SYBR Green Supermix（美国Bio-rad公司），PrimeScript RT Master Mix反转录酶试剂盒（日本TaKaRa公司）。

2.细胞培养：用含10%胎牛血清、1%青链霉素的RPMI 1640培养基于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养、传代人THP-1细胞。制备1×105个/ml的细胞悬液，接种于6孔细胞培养板（每孔2 ml）及12孔细胞培养板（每孔1 ml），加入100 μg/L PMA刺激48 h后，将THP-1细胞分为3组：空白对照组，不加任何刺激物，仅用培养基处理；两性霉素B组，分别用2、4、8 mg/L（实时荧光定量反转录PCR试验）或仅用8 mg/L［酶联免疫吸附试验（ELISA）和Western印迹试验］两性霉素B处理；阳性对照组：用100 μg/L β葡聚糖（PCR试验和ELISA试验）或者100 mg/L脂多糖处理（Western印迹试验）。

3.实时荧光定量反转录PCR检测TNF-α和白细胞介素（IL）8 mRNA表达：THP-1细胞经上述处理 1、3、6 h后，TRIzol法抽提空白对照组，两性霉素B组及β葡聚糖细胞总RNA，按Prime Script RT Master Mix反转录酶试剂盒说明书将总RNA反转录为cDNA。使用实时定量PCR仪，用Syber green法对目的基因进行扩增，以β肌动蛋白作为内参照。TNF-α、IL-8及β肌动蛋白引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。TNF-α引物序列：正向引物5′-CGAGTGACAAGCCTGTAGC-3′，反向引物 5′-GGTGTGGGTGAGGAGCACAT-3′；IL-8引物：正向引物5′-GGTGCAGAGGGTTGTGGAGAA-3′，反向引物5′-GCAGACTAGGGTTGCCAGATT-3′；β 肌动蛋白引物：正向引物 5′-TCTGGCACCACACCTTCTA-3′，反向引物5′-AGGCATACAGGGACAGCAC-3′。PCR反应条件为：95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环数40。采用2-△△Ct法对目的基因变化水平进行计算，ΔCt=目的基因Ct值-内参照Ct值；样品ΔΔCt=样品ΔCt-对照组ΔCt。以对照组目的基因表达量为1，2-△△Ct值即为实验组目的基因较对照组目的基因表达的倍数，实验重复3次取均值。

4.酶联免疫吸附试验（ELISA）检测TNF-α含量：不同刺激物与THP-1细胞共培养24 h后，离心收集上清液，按试剂盒说明书检测上清液中TNF-α含量。实验重复3次取均值。

5.Western印迹检测p38MAPK和磷酸化p38MAPK水平：THP-1细胞经上述处理30 min后，裂解细胞、提取总蛋白。将蛋白（40 μg）样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，电转至聚偏二氟乙烯膜上。5%牛血清白蛋白（BSA）封闭1.5 h，加入兔抗人单克隆抗体4℃孵育过夜。TBST液（Tris-Buffered Saline Tween-20）洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG反应1.5 h，TBST液洗膜，Supersignal试剂显色发光，检测p38MAPK和磷酸化p38MAPK水平。实验重复3次取均值。

6.统计学处理：应用SPSS19.0统计软件，计量资料以±s表示。各组间mRNA表达水平、上清液TNF-α含量差异采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。用Pearson相关性分析检测两性霉素B作用浓度和时间与TNF-α和IL-8 mRNA水平之间的关系。

结 果

1.两性霉素B对TNF-α及IL-8 mRNA水平的影响：刺激6 h，不同浓度两性霉素B组、阳性对照组和空白对照组之间TNF-α mRNA表达水平差异有统计学意义（n=4，F=195.33，P ＜ 0.001），IL-8 mRNA表达水平差异也有统计学意义（n=4，F=111.63，P＜0.001），见表1。浓度为8mg/L两性霉素B刺激后不同时间点之间TNF-α及IL-8 mRNA水平差异均有统计学意义，见表2。两性霉素B对TNF-α和IL-8 mRNA水平升高呈浓度（r值分别为0.827和0.813，均P＜0.05）和时间依赖性（r值分别为0.819和0.806，均P ＜ 0.05）。

表1 不同浓度两性霉素B对THP-1细胞肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素8（IL-8）mRNA表达水平的影响（±s）

表1 不同浓度两性霉素B对THP-1细胞肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素8（IL-8）mRNA表达水平的影响（±s）

注：n=3。a与空白对照组比较，P＜0.05；b与阳性对照组比较，P＜0.05

表2 8 mg/L两性霉素B刺激不同时间对肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素8（IL-8）mRNA水平的影响（±s）

表2 8 mg/L两性霉素B刺激不同时间对肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素8（IL-8）mRNA水平的影响（±s）

注：n=3。a与空白对照组比较，P＜0.05；b与阳性对照组比较，P＜0.05

2.两性霉素B对TNF-α蛋白分泌的影响：刺激24 h后，两性霉素B组、阳性对照组、空白对照组上清液中TNF-α蛋白浓度分别为（4 039.06±223.87）、（5 253.29± 124.60）、（96.31± 0.26）ng/L，三者之间差异有统计学意义（F=78.35，P ＜0.01），两性霉素B组、阳性对照组TNF-α蛋白分泌量均高于空白对照组（P＜0.001）。

3.两性霉素B对THP-1细胞p38MAPK激活的影响：加两性霉素B刺激30 min后，THP-1细胞磷酸化p38MAPK蛋白水平明显高于空白对照组，与脂多糖组相比相似；而p38MAPK蛋白水平在刺激30 min后各组间没有明显差异。见图1。

图1 Western印迹分析两性霉素B对THP-1细胞p38MAPK激活的影响 1：空白对照组；2：8 mg/L两性霉素B刺激30 min；3：100 mg/L脂多糖刺激30 min

讨 论

体外研究显示，两性霉素B除杀伤真菌细胞外，对宿主免疫系统也有调节作用，如刺激细胞产生趋化因子、前列腺素等免疫因子并上调参与血管生成的基因表达。有实验表明，两性霉素B能增强多核中性粒细胞抗真菌活性，刺激巨噬细胞分泌一氧化氮（NO）、TNF-α和IL-1，调节机体免疫能力提高对真菌的抵抗力［5］。本研究旨在探讨两性霉素B对人THP-1细胞p38 MAPK活化以及TNF-α和IL-8分泌等的影响，从而研究抗真菌药物对人体的免疫调节作用。

TNF-α是一种具有广泛生物学效应的前炎症细胞因子。实验证明，TNF-α可促进IL-12、γ干扰素（IFN-γ）的产生，并介导树突细胞向炎症部位迁移，有助于清除新型隐球菌感染［6］，而IL-8也能有效促进多形核白细胞抑制白念珠菌生长。本研究发现，不同浓度两性霉素B作用THP-1细胞后，TNF-α和IL-8 mRNA水平呈浓度依赖性升高；同时TNF-α和IL-8 mRNA水平在两性霉素B刺激1 h后出现上升，3 h持续升高，6 h达到高峰，呈时间依赖性。本研究采用β葡聚糖（真菌细胞膜上dectin-1受体的配体）作为激活THP-1细胞的阳性对照物，其也能诱导出相同的时间依赖效应。

我们用ELISA法检测8 mg/L浓度的两性霉素B作用THP-1细胞24 h后，上清液中TNF-α含量高于空白对照组。表明两性霉素B不仅上调THP-1细胞TNF-α转录水平，而且促进该因子蛋白分泌。

研究显示，两性霉素B主要通过Toll样受体（TLR），CD14、MyD88活化下游的MAPK，主要包括p38、c-Jun氨基末端激酶（JNK）及细胞外调节激酶（ERK）几个亚族［7］。p38MAPK可将胞外信号传递至胞内，参与调控细胞增殖、分化、凋亡等。p38MAPK被激活后可以活化一些转录因子如转录活化因子1（ATF-1）、ATF-2及转录因子1（AP-1），从而调节靶基因表达，影响细胞因子产生，共同调节炎症反应［8］。

本实验结果表明，两性霉素B刺激30 min后，THP-1细胞出现p38MAPK蛋白磷酸化及TNF-α和IL-8 mRNA、蛋白表达水平的升高，且TNF-α和IL-8 mRNA水平升高在一定程度内呈现剂量和时间依赖性，表明两性霉素B在抗真菌的同时，可与免疫细胞相互作用，参与机体固有免疫反应，具有免疫调节作用。

［1］吴婷,王敏,苏欣,等.抗真菌药物与Toll样受体在固有免疫应答中的作用［J］.中国感染与化疗杂志,2015,（5）:501-504.DOI:10.3969/j.issn.1009-7708.2015.05.032.

［2］Matsuo K,Hotokezaka H,Ohara N,et al.Analysis of amphotericin B-induced cell signaling with chemical inhibitors of signaling molecules［J］.Microbiol Immunol,2006,50（4）:337-347.

［3］Muenster S,Bode C,Diedrich B,et al.Antifungal antibiotics modulate the pro-inflammatory cytokine production and phagocytic activity of human monocytes in an in vitro sepsis model［J］.Life Sci,2015,141:128-136.DOI:10.1016/j.lfs.2015.09.004.

［4］Hedges JF,Mitchell AM,Jones K,et al.Amphotericin B stimulates γδ T and NK cells,and enhances protection from Salmonella infection［J］.Innate Immun,2015,21（6）:598-608.DOI:10.1177/1753425914567692.

［5］Mesa-Arango AC,Scorzoni L,Zaragoza O.It only takes one to do many jobs:amphotericin B as antifungal and immunomodulatory drug［J］.Front Microbiol,2012,3:286.DOI:10.3389/fmicb.2012.00286.

［6］Herring AC,Falkowski NR,Chen GH,et al.Transient neutralization of tumor necrosis factor alpha can produce a chronic fungal infection in an immunocompetent host:potential role of immature dendritic cells［J］.Infect Immun,2005,73（1）:39-49.DOI:10.1128/IAI.73.1.39-49.2005.

［7］Bellocchio S,Gaziano R,Bozza S,et al.Liposomal amphotericin B activates antifungal resistance with reduced toxicity by diverting Toll-like receptor signalling from TLR-2 to TLR-4［J］.J Antimicrob Chemother,2005,55（2）:214-222.DOI:10.1093/jac/dkh542.

［8］段志敏,杜蕾蕾,曾荣,等.白念珠菌对人急性单核细胞白血病细胞系产生肿瘤坏死因子α、活化信号分子p38MAPK的影响［J］.中华皮肤科杂志,2015,（8）:535-538.DOI:10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.08.004.

Effect of amphotericin B on the production of tumor necrosis factor-α and interleukin-8 and activation of signaling molecule p38MAPK in human THP-1 cells

Ye Wenxia,Du Leilei,Duan Zhimin,Liu Caixia,Li Min,Gao Yu
Department of Dermatology,The 2nd Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325000,Zhejiang,China（Ye WX［current affiliation:Department of Dermatology,Lishui People′s Hospital,The Sixth Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Lishui 323000,Zhejiang,China］,Gao Y）;Department of Mycology,Hospital of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China（Du LL,Duan ZM,Liu CX,Li M）

s:Gao Yu,Email:gaoyu@medmail.com.cn;Li Min,Email:drlimin@sina.com

Objective To evaluate the effect of amphotericin B on the production of tumor necrosis factor-α（TNF-α）and interleukin-8（IL-8）and activation of p38 mitogen-activated protein kinases（p38MAPK）in a human acute monocytic leukemia cell line（THP-1）.Methods Cultured THP-1 cells were divided into several groups:blank control group receiving no treatment,amphotericin B groups treated with 2,4 and 8 mg/L amphotericin B separately,positive control group treated with 100 μg/L β -glucosan or 100 mg/L lipopolysaccharide.Real-time fluorescence-based quantitative PCR was performed to determine the mRNA expression of TNF-α and IL-8 after the THP-1 cells were treated with different stimuli for some durations.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was conducted to detect the level of TNF-α in the culture supernatant of THP-1 cells after 24-hour treatment with 8 mg/L amphotericin B,and Western blot analysis to measure the levels of p38MAPK and phosphorylated p38MAPK after 30-minute treatment with 8 mg/L amphotericin B.Results After 6-hour treatment with 2,4 and 8 mg/L amphotericin B separately,the mRNA levels of TNF-α in THP-1 cells（7.55 ± 1.17,19.47 ± 2.91,57.22 ± 0.65）and IL-8（2.98±0.04,5.22±1.35,11.82±1.66）were all significantly higher than those in the blank control group（TNF-α:1.00±0.07,P＜0.01,0.001,0.001 respectively;IL-8:1.01±0.23,P＜0.01,0.001,0.001 respectively）.After the treatment with 8 mg/L amphotericin B for 1,3,6 hours,the mRNA levels of TNF-α（8.61±0.30,10.75±0.08,56.98±2.43）and IL-8（2.63±0.28,5.35±0.98,11.73±1.18）in THP-1 cells were all significantly higher than those in the blank control group（TNF-α:1.18±0.17,P ＜0.05,0.01,0.001;IL-8:1.23±0.11,P＜0.05,0.01,0.001）.After 24-hour treatment with 8 mg/L amphotericin B,the level of TNF-α in the culture supernatant of THP-1 cells was significantly higher than that in the blank control group（4 039.06±223.87 ng/L vs.96.31±0.26 ng/L,P＜0.001）.Conclusion Amphotericin B can promote the p38MAPK phosphorylation and increase the levels of TNF-α and IL-8 in human THP-1 cells in vitro,suggesting its immunomodulatory effects.

Amphotericin B;Tumor necrosis factor-alpha;Interleukin-8;p38 Mitogen-activated protein kinases;THP-1 monocytes

高宇，Email：gaoyu@medmail.com.cn；李岷，Email：drlimin@sina.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2017.10.008

国家自然科学基金（81371750）、国家重点基础研究发展计划973计划（2013CB536005）、江苏省“333高层次人才培养工程”项目，江苏省“六大人才高峰”项目（2013-WSW-039、2013-WSW-090）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81371750）;National Basic Research Program（973 Program）of China（2013CB536005）;333 High-level Talents Training Project of Jiangsu Province（2013-WSW-039）;Six Talents Peak Project of Jiangsu Province（2013-WSW-090）

2016-11-22）

（本文编辑：尚淑贤）