两性霉素B对人THP-1细胞产生肿瘤坏死因子α、白细胞介素8及p38MAPK活化的影响

2017-12-12 01:40叶雯霞杜蕾蕾段志敏刘彩霞李岷高宇
中华皮肤科杂志 2017年10期
关键词:两性霉素介素空白对照

叶雯霞 杜蕾蕾 段志敏 刘彩霞 李岷 高宇

325000温州医科大学附属第二医院皮肤科[叶雯霞(现在温州医科大学附属第六医院丽水市人民医院皮肤科,323000)、高宇];中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病医院真菌科(杜蕾蕾、段志敏、刘彩霞、李岷)

两性霉素B对人THP-1细胞产生肿瘤坏死因子α、白细胞介素8及p38MAPK活化的影响

叶雯霞 杜蕾蕾 段志敏 刘彩霞 李岷 高宇

325000温州医科大学附属第二医院皮肤科[叶雯霞(现在温州医科大学附属第六医院丽水市人民医院皮肤科,323000)、高宇];中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病医院真菌科(杜蕾蕾、段志敏、刘彩霞、李岷)

目的 探讨两性霉素B对人急性单核细胞白血病细胞系THP-1细胞系分泌肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素8(IL-8)以及p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)活化的影响。方法 将THP-1细胞分为空白对照组、两性霉素B组(分别加入2、4、8 mg/L两性霉素B处理);阳性对照组(用100 μg/L β葡聚糖或者100 mg/L脂多糖处理)。实时荧光定量PCR分析不同刺激物和THP-1细胞作用一定时间后TNF-α、IL-8 mRNA表达水平。酶联免疫吸附试验检测8 mg/L两性霉素B刺激THP-1细胞24 h后上清液中TNF-α分泌量。Western印迹检测8 mg/L两性霉素B作用THP-1细胞后p38MAPK和磷酸化p38MAPK的水平。结果 2、4、8 mg/L两性霉素B刺激6 h,TNF-α mRNA水平分别为7.55±1.17、19.47±2.91、57.22±0.65,与空白对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.01、0.001、0.001)。IL-8 mRNA水平分别为2.98± 0.04、5.22±1.35、11.82±1.66,与空白对照组比较,差异均有统计学意义(P < 0.01、0.001、0.001)。8 mg/L两性霉素B刺激THP-1细胞1、3、6 h后TNF-α mRNA水平分别为8.61±0.30、10.75±0.08、56.98±2.43,与空白对照组比较,差异均有统计学意义(P <0.05、0.01、0.001)。IL-8 mRNA水平分别为2.63±0.28、5.35±0.98、11.73±1.18,与空白对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05、0.01、0.001)。8 mg/L两性霉素B刺激THP-1细胞24 h上清液中TNF-α蛋白水平为(4 039.06±223.87)ng/L,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.001)。结论两性霉素B体外可促进人THP-1细胞p38MAPK蛋白磷酸化及TNF-α和IL-8分泌,具有免疫调节作用。

两性霉素B;肿瘤坏死因子α;白细胞介素8;p38丝裂原活化蛋白激酶类;单核细胞THP-1

两性霉素B是经典的多烯类抗真菌药物,抗菌谱广,可用于治疗念珠菌、曲霉、隐球菌引起的系统感染,是重症真菌感染治疗的基石[1]。近年研究显示,两性霉素B除了对真菌有直接杀灭作用外,还对宿主免疫系统具有调节作用[2-4]。本研究旨在探讨两性霉素B在调节固有免疫中的作用。

材料与方法

1.细胞和主要试剂:人单核细胞白血病细胞株(THP-1细胞株)来自美国模式培养物集存库(ATCC)。两性霉素B为美国Sigma公司产品,用二甲基亚砜(DMSO)配制成不同浓度待用。兔抗人p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷酸化p38 MAPK抗体(美国Cell Signaling Technology公司),iTaq Universal SYBR Green Supermix(美国Bio-rad公司),PrimeScript RT Master Mix反转录酶试剂盒(日本TaKaRa公司)。

2.细胞培养:用含10%胎牛血清、1%青链霉素的RPMI 1640培养基于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养、传代人THP-1细胞。制备1×105个/ml的细胞悬液,接种于6孔细胞培养板(每孔2 ml)及12孔细胞培养板(每孔1 ml),加入100 μg/L PMA刺激48 h后,将THP-1细胞分为3组:空白对照组,不加任何刺激物,仅用培养基处理;两性霉素B组,分别用2、4、8 mg/L(实时荧光定量反转录PCR试验)或仅用8 mg/L[酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western印迹试验]两性霉素B处理;阳性对照组:用100 μg/L β葡聚糖(PCR试验和ELISA试验)或者100 mg/L脂多糖处理(Western印迹试验)。

3.实时荧光定量反转录PCR检测TNF-α和白细胞介素(IL)8 mRNA表达:THP-1细胞经上述处理 1、3、6 h后,TRIzol法抽提空白对照组,两性霉素B组及β葡聚糖细胞总RNA,按Prime Script RT Master Mix反转录酶试剂盒说明书将总RNA反转录为cDNA。使用实时定量PCR仪,用Syber green法对目的基因进行扩增,以β肌动蛋白作为内参照。TNF-α、IL-8及β肌动蛋白引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。TNF-α引物序列:正向引物5′-CGAGTGACAAGCCTGTAGC-3′,反向引物 5′-GGTGTGGGTGAGGAGCACAT-3′;IL-8引物:正向引物5′-GGTGCAGAGGGTTGTGGAGAA-3′,反向引物5′-GCAGACTAGGGTTGCCAGATT-3′;β 肌动蛋白引物:正向引物 5′-TCTGGCACCACACCTTCTA-3′,反向引物5′-AGGCATACAGGGACAGCAC-3′。PCR反应条件为:95℃预变性10 min,95℃变性15 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,循环数40。采用2-△△Ct法对目的基因变化水平进行计算,ΔCt=目的基因Ct值-内参照Ct值;样品ΔΔCt=样品ΔCt-对照组ΔCt。以对照组目的基因表达量为1,2-△△Ct值即为实验组目的基因较对照组目的基因表达的倍数,实验重复3次取均值。

4.酶联免疫吸附试验(ELISA)检测TNF-α含量:不同刺激物与THP-1细胞共培养24 h后,离心收集上清液,按试剂盒说明书检测上清液中TNF-α含量。实验重复3次取均值。

5.Western印迹检测p38MAPK和磷酸化p38MAPK水平:THP-1细胞经上述处理30 min后,裂解细胞、提取总蛋白。将蛋白(40 μg)样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后,电转至聚偏二氟乙烯膜上。5%牛血清白蛋白(BSA)封闭1.5 h,加入兔抗人单克隆抗体4℃孵育过夜。TBST液(Tris-Buffered Saline Tween-20)洗膜后,加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG反应1.5 h,TBST液洗膜,Supersignal试剂显色发光,检测p38MAPK和磷酸化p38MAPK水平。实验重复3次取均值。

6.统计学处理:应用SPSS19.0统计软件,计量资料以±s表示。各组间mRNA表达水平、上清液TNF-α含量差异采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验,P<0.05为差异有统计学意义。用Pearson相关性分析检测两性霉素B作用浓度和时间与TNF-α和IL-8 mRNA水平之间的关系。

结 果

1.两性霉素B对TNF-α及IL-8 mRNA水平的影响:刺激6 h,不同浓度两性霉素B组、阳性对照组和空白对照组之间TNF-α mRNA表达水平差异有统计学意义(n=4,F=195.33,P < 0.001),IL-8 mRNA表达水平差异也有统计学意义(n=4,F=111.63,P<0.001),见表1。浓度为8mg/L两性霉素B刺激后不同时间点之间TNF-α及IL-8 mRNA水平差异均有统计学意义,见表2。两性霉素B对TNF-α和IL-8 mRNA水平升高呈浓度(r值分别为0.827和0.813,均P<0.05)和时间依赖性(r值分别为0.819和0.806,均P < 0.05)。

表1 不同浓度两性霉素B对THP-1细胞肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素8(IL-8)mRNA表达水平的影响(±s)

表1 不同浓度两性霉素B对THP-1细胞肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素8(IL-8)mRNA表达水平的影响(±s)

注:n=3。a与空白对照组比较,P<0.05;b与阳性对照组比较,P<0.05

表2 8 mg/L两性霉素B刺激不同时间对肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素8(IL-8)mRNA水平的影响(±s)

表2 8 mg/L两性霉素B刺激不同时间对肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素8(IL-8)mRNA水平的影响(±s)

注:n=3。a与空白对照组比较,P<0.05;b与阳性对照组比较,P<0.05

2.两性霉素B对TNF-α蛋白分泌的影响:刺激24 h后,两性霉素B组、阳性对照组、空白对照组上清液中TNF-α蛋白浓度分别为(4 039.06±223.87)、(5 253.29± 124.60)、(96.31± 0.26)ng/L,三者之间差异有统计学意义(F=78.35,P <0.01),两性霉素B组、阳性对照组TNF-α蛋白分泌量均高于空白对照组(P<0.001)。

3.两性霉素B对THP-1细胞p38MAPK激活的影响:加两性霉素B刺激30 min后,THP-1细胞磷酸化p38MAPK蛋白水平明显高于空白对照组,与脂多糖组相比相似;而p38MAPK蛋白水平在刺激30 min后各组间没有明显差异。见图1。

图1 Western印迹分析两性霉素B对THP-1细胞p38MAPK激活的影响 1:空白对照组;2:8 mg/L两性霉素B刺激30 min;3:100 mg/L脂多糖刺激30 min

讨 论

体外研究显示,两性霉素B除杀伤真菌细胞外,对宿主免疫系统也有调节作用,如刺激细胞产生趋化因子、前列腺素等免疫因子并上调参与血管生成的基因表达。有实验表明,两性霉素B能增强多核中性粒细胞抗真菌活性,刺激巨噬细胞分泌一氧化氮(NO)、TNF-α和IL-1,调节机体免疫能力提高对真菌的抵抗力[5]。本研究旨在探讨两性霉素B对人THP-1细胞p38 MAPK活化以及TNF-α和IL-8分泌等的影响,从而研究抗真菌药物对人体的免疫调节作用。

TNF-α是一种具有广泛生物学效应的前炎症细胞因子。实验证明,TNF-α可促进IL-12、γ干扰素(IFN-γ)的产生,并介导树突细胞向炎症部位迁移,有助于清除新型隐球菌感染[6],而IL-8也能有效促进多形核白细胞抑制白念珠菌生长。本研究发现,不同浓度两性霉素B作用THP-1细胞后,TNF-α和IL-8 mRNA水平呈浓度依赖性升高;同时TNF-α和IL-8 mRNA水平在两性霉素B刺激1 h后出现上升,3 h持续升高,6 h达到高峰,呈时间依赖性。本研究采用β葡聚糖(真菌细胞膜上dectin-1受体的配体)作为激活THP-1细胞的阳性对照物,其也能诱导出相同的时间依赖效应。

我们用ELISA法检测8 mg/L浓度的两性霉素B作用THP-1细胞24 h后,上清液中TNF-α含量高于空白对照组。表明两性霉素B不仅上调THP-1细胞TNF-α转录水平,而且促进该因子蛋白分泌。

研究显示,两性霉素B主要通过Toll样受体(TLR),CD14、MyD88活化下游的MAPK,主要包括p38、c-Jun氨基末端激酶(JNK)及细胞外调节激酶(ERK)几个亚族[7]。p38MAPK可将胞外信号传递至胞内,参与调控细胞增殖、分化、凋亡等。p38MAPK被激活后可以活化一些转录因子如转录活化因子1(ATF-1)、ATF-2及转录因子1(AP-1),从而调节靶基因表达,影响细胞因子产生,共同调节炎症反应[8]。

本实验结果表明,两性霉素B刺激30 min后,THP-1细胞出现p38MAPK蛋白磷酸化及TNF-α和IL-8 mRNA、蛋白表达水平的升高,且TNF-α和IL-8 mRNA水平升高在一定程度内呈现剂量和时间依赖性,表明两性霉素B在抗真菌的同时,可与免疫细胞相互作用,参与机体固有免疫反应,具有免疫调节作用。

[1]吴婷,王敏,苏欣,等.抗真菌药物与Toll样受体在固有免疫应答中的作用[J].中国感染与化疗杂志,2015,(5):501-504.DOI:10.3969/j.issn.1009-7708.2015.05.032.

[2]Matsuo K,Hotokezaka H,Ohara N,et al.Analysis of amphotericin B-induced cell signaling with chemical inhibitors of signaling molecules[J].Microbiol Immunol,2006,50(4):337-347.

[3]Muenster S,Bode C,Diedrich B,et al.Antifungal antibiotics modulate the pro-inflammatory cytokine production and phagocytic activity of human monocytes in an in vitro sepsis model[J].Life Sci,2015,141:128-136.DOI:10.1016/j.lfs.2015.09.004.

[4]Hedges JF,Mitchell AM,Jones K,et al.Amphotericin B stimulates γδ T and NK cells,and enhances protection from Salmonella infection[J].Innate Immun,2015,21(6):598-608.DOI:10.1177/1753425914567692.

[5]Mesa-Arango AC,Scorzoni L,Zaragoza O.It only takes one to do many jobs:amphotericin B as antifungal and immunomodulatory drug[J].Front Microbiol,2012,3:286.DOI:10.3389/fmicb.2012.00286.

[6]Herring AC,Falkowski NR,Chen GH,et al.Transient neutralization of tumor necrosis factor alpha can produce a chronic fungal infection in an immunocompetent host:potential role of immature dendritic cells[J].Infect Immun,2005,73(1):39-49.DOI:10.1128/IAI.73.1.39-49.2005.

[7]Bellocchio S,Gaziano R,Bozza S,et al.Liposomal amphotericin B activates antifungal resistance with reduced toxicity by diverting Toll-like receptor signalling from TLR-2 to TLR-4[J].J Antimicrob Chemother,2005,55(2):214-222.DOI:10.1093/jac/dkh542.

[8]段志敏,杜蕾蕾,曾荣,等.白念珠菌对人急性单核细胞白血病细胞系产生肿瘤坏死因子α、活化信号分子p38MAPK的影响[J].中华皮肤科杂志,2015,(8):535-538.DOI:10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.08.004.

Effect of amphotericin B on the production of tumor necrosis factor-α and interleukin-8 and activation of signaling molecule p38MAPK in human THP-1 cells

Ye Wenxia,Du Leilei,Duan Zhimin,Liu Caixia,Li Min,Gao Yu
Department of Dermatology,The 2nd Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325000,Zhejiang,China(Ye WX[current affiliation:Department of Dermatology,Lishui People′s Hospital,The Sixth Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Lishui 323000,Zhejiang,China],Gao Y);Department of Mycology,Hospital of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China(Du LL,Duan ZM,Liu CX,Li M)

s:Gao Yu,Email:gaoyu@medmail.com.cn;Li Min,Email:drlimin@sina.com

Objective To evaluate the effect of amphotericin B on the production of tumor necrosis factor-α(TNF-α)and interleukin-8(IL-8)and activation of p38 mitogen-activated protein kinases(p38MAPK)in a human acute monocytic leukemia cell line(THP-1).Methods Cultured THP-1 cells were divided into several groups:blank control group receiving no treatment,amphotericin B groups treated with 2,4 and 8 mg/L amphotericin B separately,positive control group treated with 100 μg/L β -glucosan or 100 mg/L lipopolysaccharide.Real-time fluorescence-based quantitative PCR was performed to determine the mRNA expression of TNF-α and IL-8 after the THP-1 cells were treated with different stimuli for some durations.Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)was conducted to detect the level of TNF-α in the culture supernatant of THP-1 cells after 24-hour treatment with 8 mg/L amphotericin B,and Western blot analysis to measure the levels of p38MAPK and phosphorylated p38MAPK after 30-minute treatment with 8 mg/L amphotericin B.Results After 6-hour treatment with 2,4 and 8 mg/L amphotericin B separately,the mRNA levels of TNF-α in THP-1 cells(7.55 ± 1.17,19.47 ± 2.91,57.22 ± 0.65)and IL-8(2.98±0.04,5.22±1.35,11.82±1.66)were all significantly higher than those in the blank control group(TNF-α:1.00±0.07,P<0.01,0.001,0.001 respectively;IL-8:1.01±0.23,P<0.01,0.001,0.001 respectively).After the treatment with 8 mg/L amphotericin B for 1,3,6 hours,the mRNA levels of TNF-α(8.61±0.30,10.75±0.08,56.98±2.43)and IL-8(2.63±0.28,5.35±0.98,11.73±1.18)in THP-1 cells were all significantly higher than those in the blank control group(TNF-α:1.18±0.17,P <0.05,0.01,0.001;IL-8:1.23±0.11,P<0.05,0.01,0.001).After 24-hour treatment with 8 mg/L amphotericin B,the level of TNF-α in the culture supernatant of THP-1 cells was significantly higher than that in the blank control group(4 039.06±223.87 ng/L vs.96.31±0.26 ng/L,P<0.001).Conclusion Amphotericin B can promote the p38MAPK phosphorylation and increase the levels of TNF-α and IL-8 in human THP-1 cells in vitro,suggesting its immunomodulatory effects.

Amphotericin B;Tumor necrosis factor-alpha;Interleukin-8;p38 Mitogen-activated protein kinases;THP-1 monocytes

高宇,Email:gaoyu@medmail.com.cn;李岷,Email:drlimin@sina.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2017.10.008

国家自然科学基金(81371750)、国家重点基础研究发展计划973计划(2013CB536005)、江苏省“333高层次人才培养工程”项目,江苏省“六大人才高峰”项目(2013-WSW-039、2013-WSW-090)

Fund programs:National Natural Science Foundation of China(81371750);National Basic Research Program(973 Program)of China(2013CB536005);333 High-level Talents Training Project of Jiangsu Province(2013-WSW-039);Six Talents Peak Project of Jiangsu Province(2013-WSW-090)

2016-11-22)

(本文编辑:尚淑贤)

猜你喜欢
两性霉素介素空白对照
小麦不同肥力下经济效益试验研究
外源性透明质酸对人牙周膜细胞增殖及成牙骨质、成纤维分化的影响
血清白细胞介素-37与慢性阻塞性肺疾病急性加重期并发呼吸衰竭患者预后的相关性
心力衰竭患者白细胞介素6、CRP表达水平与预后的相关性探讨
不同剂量两性霉素B鞘内注射联合脑脊液持续引流置换治疗新型隐球菌性脑膜炎的对比
白细胞介素-37在冠心病中作用的研究进展
例析阴性对照与阳性对照在高中生物实验教学中的应用
病理确诊的肺毛霉菌病五例临床分析
铜和镉对草鱼肾脏中3种白细胞介素基因表达的影响
两性霉素B脂质体穿透真菌细胞壁将两性霉素B直接传递至细胞膜上的麦角固醇