检测真菌毒素酶联免疫试剂盒的筛选

梁利军，王丽娟

（1.山西省粮油科学研究所，山西太原 030024；2.山西粮食质量监测中心，山西太原 030024）

检测真菌毒素酶联免疫试剂盒的筛选

梁利军1，王丽娟2

（1.山西省粮油科学研究所，山西太原 030024；2.山西粮食质量监测中心，山西太原 030024）

真菌毒素是粮油食品的主要污染物之一，在适宜的条件下不断产生，它们广泛存在并一直威胁着人类和动物的健康。随着全球经济一体化的进程，对真菌毒素的限量标准越来越严格，对检测技术也提出了更高的要求。收集了7种ELISA试剂盒的相关资料，通过对其主要参数进行分析，为用户选择试剂盒提出了相关建议。

酶联免疫试剂盒；真菌毒素；筛选；性能

据世界粮农组织（FAO） 报告，全球每年约有25%的农作物遭受不同程度的真菌毒素污染，据估算全球每年因真菌毒素污染而造成的直接或间接损失达数百亿美元[1]。目前，我国某些地区农作物中真菌毒素污染严重，有的甚至超过国家限量标准的几十倍，是粮食安全的重大隐患，真菌毒素的有效监测已列入当前食品安全监测的重点。建立在酶联免疫吸附分析（ELISA）技术基础上的真菌毒素快速检测试剂盒，以其快速简便、价格相对低廉的特点，已在粮食的真菌毒素检验工作中广泛使用。目前，诸多商品化的ELISA快速检测试剂盒的面世为人们提供了更多选择机会。在选择ELISA快速检测试剂盒过程中，收集了7种ELISA试剂盒的相关资料，通过对技术指标、操作条件、特异性等方面的比对分析提出的一些选择建议。

1 技术指标

不同品牌的ELISA快速检测试剂盒的各项技术指标存在着一定的差异。

黄曲霉毒素B1的技术指标见表1，呕吐毒素的技术指标见表2，玉米赤霉烯酮的技术指标见表3。

表1 黄曲霉毒素B1的技术指标

表2 呕吐毒素的技术指标

1.1 检测范围

在我国市场销售的ELISA试剂盒，其检测范围基本都覆盖国内的限量标准，但各种ELISA试剂盒的标准溶液表达方式和标准溶液浓度有差异。

1.1.1 标准溶液工作曲线的表达方式

标准溶液的工作曲线采用了2种表达方式：一种是将稀释倍数包含在标准溶液的工作曲线中，按照ELISA试剂盒的说明书操作，可直接读出样品中真菌毒素的含量，如国产2和进口1；另外一种是在标准溶液的工作曲线中查到样品的浓度，再通过计算得到样品中真菌毒素的含量，如国产1、进口2等5种。

1.1.2 标准溶液的工作曲线浓度范围

7种ELISA试剂盒的标准溶液的浓度范围有较大差异，浓度范围最大的是0～8.1 ng/mL，浓度范围最小的是0～0.8 ng/mL。

浓度范围较宽的曲线见图1，浓度范围较窄的曲线见图2。

表3 玉米赤霉烯酮的技术指标

图1 浓度范围较宽的曲线

图2 浓度范围较窄的曲线

由于ELISA方法中吸光度比值的百分率与浓度对数成相关性，低浓度时对应的吸光度比值百分率变化大，而高浓度时对应的吸光度比值百分率变化小。例如，黄曲霉毒素B1质量浓度在0.1～1.0 ng/mL时，吸光度比值的百分率变化为95%～28%；质量浓度在1.0～10.0 ng/mL时，吸光度比值的百分率变化为28%～14%，其中质量浓度在5.0～10.0 ng/mL时，吸光度比值的百分率变化只有约3%。质量浓度低时工作曲线的线性较好，浓度高时工作曲线的线性较差，说明浓度高的区域重现。

在选择ELISA试剂盒时，如果检测目的是进行初步筛查，尽量选择标准溶液浓度范围较宽的ELISA试剂盒；如果检测目的是对毒素进行定量检测，就需要选择标准溶液浓度范围较窄的ELISA试剂盒。对毒素含量较高的样品定量检测时，还需将样品溶液稀释，样品溶液的浓度尽量落在标准溶液工作曲线的前端进行测试。

1.2 变异系数

由于ELISA试剂盒的制作工艺和质量控制的不同，其批内和批间都有一定的差异。批内、批间的差异是影响重现性的主要因素，是选择试剂盒的关键所在。批内、批间变异系数越低，试剂盒的重现性、精密度越好。进口试剂盒批内、批间变异系数＜10%。批间误差可通过控制采购量，尽量做到每批检测使用同一批次的ELISA试剂盒。

2 操作条件

不同品牌的ELISA试剂盒，其操作条件存在着较大的差异。

黄曲霉毒素B1的操作条件见表4，呕吐毒素的操作条件见表5，玉米赤霉烯酮的操作条件见表6。

表4 黄曲霉毒素B1的操作条件

表5 呕吐毒素的操作条件

2.1 提取时间

7种ELISA试剂盒的提取时间在2～20 min，但使用的提取剂并无大的差异，在购买ELISA试剂盒时尽量选择提取时间较短的产品，这样可缩短整个试验的操作时间。

2.2 孵育温度

孵育温度有室温和37℃2种。37℃孵育需恒温、恒湿设备；室温孵育的ELISA试剂盒不需辅助设备，在操作时比较方便。

2.3 孵育次数和时间

ELISA试剂盒在检测毒素时孵育次数和时间是决定检测速度的重要因素，各种ELISA试剂盒的孵育次数和时间不同。例如，呕吐毒素孵育次数多的为3次，孵育时间长达105 min；孵育次数少的为2次，孵育时间仅为8 min，最少相差97 min（每次孵育后都需要洗板，孵育次数多的洗板次数增加，消耗的时间要多）。

孵育温度无需严格控制、孵育次数少、孵育时间短的ELISA试剂盒的内在质量较优。

在ELISA试剂盒的选择时要注意操作条件的差异，应根据实验室的设备条件和检验任务量的多少决定。选择提取时间、孵育时间短，孵育次数少，并且在室温即可孵育的ELISA试剂盒可减少操作误差，提高检测效率。

3 特异性

表6 玉米赤霉烯酮的操作条件

特异性一般用交叉反应率来表达，交叉反应是指试剂盒中包被的抗体与目标测定物及相似的物质的反应能力。例如，测定黄曲霉毒素B1的试剂盒可能也会与黄曲霉毒素B2，黄曲霉毒素G1，黄曲霉毒素G1，黄曲霉毒素M1发生不同程度的交叉反应，其他物质的交叉反应率越高，说明试剂盒的特异性越差，出现假阳性的几率就越大。目前，未收集到国产试剂盒的交叉反应率，大部分进口试剂盒都提供交叉反应率。客观上试剂盒都存在交叉反应，提供交叉反应率的试剂盒在排除假阳性时有目标，未提供交叉反应率的试剂盒存在假阳性的不确定性较大，如果出现阳性结果，要以其他方式（如液相色谱等方法）加以验证，以便得到比较可靠的数据。

3种毒素（AFB1、DON、ZEN） 的交叉反应率见表7，黄曲霉毒素B1的交叉反率见表8，呕吐毒素的交叉反率见表9，玉米赤霉烯酮的交叉反率见表10。

由表7可见，6个品牌的产品与3种毒素（AFB1，DON，ZEN） 的交叉反应率都是100%，有一个品牌未提供。有3个品牌的产品提供了3种毒素（AFB1，DON，ZEN） 分别与相关物质的交叉反应，并且与相关物质的交叉反应差别较大，其余4个品牌的产品未提供。

表7 3种毒素（AFB1，DON，ZEN） 的交叉反应率/%

表8 黄曲霉毒素B1的交叉反应率/%

表9 呕吐毒素的交叉反应率/%

表10 玉米赤霉烯酮的交叉反应率/%

4 结论

综上所述，ELISA试剂盒的选用应从技术指标、操作条件的差异、特异性和检验目的等方面综合考虑。在技术性能方面满足实验室要求的前提下，再考虑成本问题，最终选择适合实验室的ELISA试剂盒。

[1]郭卫，韩小贤，李洋，等.粮油食品中真菌毒素的研究进展 [J].食品工程，2010（7）：104.

[2]中华人民共和国国家卫生与计划生育委员会.GB 5009.22—2016食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定 [S].北京：中国标准出版社，2016：10-12.

[3]中华人民共和国国家卫生与计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.GB 5009.111—2016食品安全国家标准食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰衍生物的测定 [S].北京：中国标准出版社，2016：53-61.

[4]GB 5009.209—2016食品安全国家标准食品中玉米赤霉烯酮的测定 [S].北京：中国标准出版社，2016：25-30.◇

Screening of Enzyme-linked Immunosorbent Kit in Detection Mycotoxin

LIANG Lijun1，WANG Lijuan2
（1.Shanxi Institute of Grain and Oil Science，Taiyuan，Shanxi 030024，China；2.Shanxi Food Quality Monitoring Center，Taiyuan，Shanxi 030024，China）

Mycotoxins is one of the main pollutants of the grain and oil food.Under the condition of appropriate，they are constantly produced widespread and have been threatening the health of humans and animals.As the global economic integration process，the standard of the limit to of mycotoxins has become more and more strict，the detection technology is also put forward higher requirements.This paper collected seven ELISA kit of related data to make some proposals for the kit choosing through the analysis of its main parameters.

ELISA KIT；mycotoxins；filtrate；performance

R155.5

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.11.016

1671-9646（2017） 11a-0053-03

2017-09-23

梁利军（1985— ），女，本科，助理工程师，研究方向为食品质量与安全。