脊髓ERK活化在瑞芬太尼引起的大鼠痛觉过敏中的作用

楼莹莹，刘 越，雷洪伊，纪术峰

（1中山市中医院麻醉科，广东中山528400；2南方医科大学珠江医院，广东广州510282）

脊髓ERK活化在瑞芬太尼引起的大鼠痛觉过敏中的作用

楼莹莹1，刘 越2，雷洪伊2，纪术峰2

（1中山市中医院麻醉科，广东中山528400；2南方医科大学珠江医院，广东广州510282）

目的：探讨大鼠脊髓ERK活化在瑞芬太尼引起痛觉过敏中的作用．方法：选择雄性SD大鼠32只，随机分为4组．对照组（n＝8，C 组）：鞘内注射PBS液20 μL，30 min后，静脉注入生理盐水1．5 mL·h-1，持续4 h；瑞芬太尼加PBS液组（n＝8，R+P组）：鞘内注射PBS液30 min后，泵入瑞芬太尼；瑞芬太尼加二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）组（n＝8，R+D 组）：鞘内注射 DMSO 10 μL，静脉泵注瑞芬太尼；瑞芬太尼加 U1026组（n＝8，R+U 组）：鞘内注射 U1026 10 μL、PBS液10 μL冲管30 min后，泵入瑞芬太尼．瑞芬太尼注射速度1 μg·min-1·kg-1，注射 4 h．分别于术前（T0）、鞘内给药前（Tc）、停药后 0．5 h、1 h、2 h 及 24 h（分别为 T1～T4）不同时点测定右足的机械性痛觉阈值．雄性SD大鼠16只，按上述分组方法随机分为4组，每组4只．每组在停药2 h后，取脊髓，应用免疫组化方法观察脊髓p-ERK阳性细胞数目．结果：R+P组、R+D组、R+U组在停药后0．5 h、1 h和2 h机械性痛阈值较术前及C组基础痛阈值显著降低（P＜0．001），停药后1 h痛阈值降至最低（P＜0．001），术后 24 h恢复至基础水平．R+P组、R+D组及R+U组组间痛阈值比较，差异无统计学意义（P＞0．05）．大鼠脊髓p-ERK阳性细胞数四组间比较，差异无统计学意义（P＞0．05）．结论：大鼠持续输注瑞芬太尼4 h后痛觉敏感性增加，与脊髓ERK活化可能无关．

瑞芬太尼；痛觉过敏；脊髓

0 引言

瑞芬太尼为新型超短效的μ-阿片受体激动剂，通过血浆和组织中非特异性酯酶代谢，起效快，消除半衰期短，为理想的阿片类药物，是全身麻醉中常用的镇痛药物．但近年来发现瑞芬太尼停药后可导致痛觉敏感性增加，即瑞芬太尼引起的痛觉过敏，影响术后镇痛治疗的效果［1-2］．瑞芬太尼引起的痛觉过敏机制尚未明了，脊髓中细胞外信号调节蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase， ERK）活化是维持和调节痛觉中枢敏化的重要机制，研究表明ERK路径参与吗啡耐受形成及痛觉过敏的形成［3］，脊髓ERK活化在瑞芬太尼引起痛觉过敏中的作用有待研究．本研究通过鞘内注射ERK上游分裂原活化激酶（mitogen-activated protein／extracellular signal-regulated kinase kinase，MEK）抑制剂U1026，观察其对瑞芬太尼引起痛觉过敏的影响，应用免疫组化方法测定脊髓p-ERK阳性细胞数目，研究脊髓ERK磷酸化在瑞芬太尼引起痛觉过敏中的作用．

1 材料和方法

1．1 实验动物及材料 选取健康雄性SD大鼠56只，体质量 220～250 g，合格证号：SCXK（粤）2006-0015，由南方医科大学动物中心提供．YLS-3E电子压痛仪（山东省医学科学院设备站），盐酸瑞芬太尼（宜昌人福药业有限公司，产品批号：080907），U1026（美国Promega公司），DMSO，兔抗p-ERK多克隆抗体（美国Santa Cruz公司），免疫组化试剂盒（福建迈新生物技术公司）．

1．2 大鼠颈静脉置管及鞘内置管 大鼠单笼饲养2 d适应环境，测量右足的机械性痛觉阈值．10%水合氯醛（0．35 mL／100 g）腹腔内注射麻醉．颈内静脉置管参照Chen等［3］研究，分离右颈静脉，将硬膜外导管（内径0．7 mm）置入颈静脉，妥善固定．大鼠鞘内置管参考雷洪伊等［4］研究，大鼠俯卧位于操作台，背部正中线L3～L4间隙切开皮肤，暴露上、下关节突及黄韧带．穿破黄韧带、硬脊膜及蛛网膜，经破口向尾侧置入PE-10导管，置入2 cm，有清亮脑脊液流出后固定导管．术后1 d经PE-10导管注射2%利多卡因20 μL，30 s内大鼠双下肢麻痹，夹尾反射消失，表明鞘内置管模型制备成功．

1．3 动物分组与处理 雄性 SD大鼠32只，分为4组．对照组（n＝8，C 组），鞘注射 PBS液 20 μL，30 min后，静脉导管持续泵入生理盐水1．5 mL·h-1，持续4 h；瑞芬太尼加PBS液组（n＝8，R+P组），鞘内注射PBS液20 μL，静脉泵入瑞芬太尼；瑞芬太尼加DMSO 组（n＝8，R+D 组）鞘内注射 DMSO 10 μL，PBS液10 μL冲管，静注瑞芬太尼；瑞芬太尼加U1026组（n＝8，R+U 组），鞘内注射 U1026 10 μL 后，PBS 液10 μL冲管30 min后，静脉泵入瑞芬太尼．瑞芬太尼注射速度 1 μg·min-1·kg-1，药物浓度 10 μg／mL，持续注射4 h．在置管前（T0）、给药前（Tc）、停药后0．5 h、1 h、2 h 及 24 h（分别为 T1～T4）不同时点测定右足的机械性痛觉阈值．

1．4 机械性痛觉阈值的测定 机械性痛阈测定参考［4］，采用YLS-3E电子压痛仪，大鼠放置于透明固定器内里适应10 min．将右足置于电子压痛仪压头下，对准于2、3跖骨间施加压力，大鼠缩爪或尖叫，停止加压，记录压力值（g），为大鼠机械痛觉阈值．每只大鼠测定3次，每次间隔1 min，取平均值，避免损伤，设定最大压力值300 g．

1．5 免疫组化染色检测大鼠脊髓背角p-ERK的表达 选取16只雄性SD大鼠，分为4组，分组方法和处理同上，每组4只，停药后2 h腹腔注射100 g／L水合氯醛（1 mL／100 g），经左心室向升主动脉插管，灌注生理盐水，打开右房，直至液体清凉，再缓慢灌注40 g／L 多聚甲醛溶液（溶于 0．1 mol／L PBS，pH7．4）400 mL，取L4～L5脊髓在灌注液中固定4 h，随后放入 30%蔗糖溶液 4℃下 24 h．冰冻切片（20 μm），然后贴附于涂有铬矾明胶的载玻片上．入4℃丙酮固定10 min，PBS 洗，5 min×3，放置在 4℃冰箱保存．

将冰冻切片室温放置30 min后，以PBS缓冲液清洗3次，3%H2O2去离子水孵育5 min，PBS液清洗5 min×3次，加入山羊血清封闭液孵育15 min，倾去血清，勿洗．加入p-ERK抗体（1∶100）4℃孵育24 h，PBS冲洗5 min×3次，然后加入第二抗体液（生物素标记山羊抗兔IgG）孵育15 min，PBS冲洗5 min×3次，再加入辣根酶标记链霉卵白素工作液孵育15 min，PBS冲洗5 min×3次．以二甲基联苯胺（diaminobenizidine，DAB）显色3～7 min，自来水充分冲洗，复染，封片．记录脊髓背角相同部位一个高倍镜视野下阳性细胞计数．

1．6 统计学处理 采用SPSS18．0统计学软件对数据进行分析，计量资料用±s表示，置管前后机械痛阈比较采用配对t检验．组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用重复测量数据的方差分析，多重比较采用LSD-t检验．大鼠脊髓p-ERK阳性细胞数目组间采用单因素方差分析．P＜0．05表示差异有统计学意义．

2 结果

2．1 各组大鼠的体质量、机械性痛阈值比较 各组大鼠的体质量、机械性痛阈值比较，差异无统计学意义（P＞0．05，表 1）．

表1 各组大鼠基本资料情况 （±s，n＝8）

表1 各组大鼠基本资料情况 （±s，n＝8）

组别 体质量（g） 右足机械性痛阈基础值（g）C 230±14．6 107．6±11．6 R+P 225．8±13．1 103．8±8．4 R+D 227．5±13．4 109．2±10．9 R+U 232．4±10．6 106．7±8．6

2．2 大鼠右足机械性痛阈值的变化情况比较 C组组内各时点痛阈值比较，差异无统计学意义（P＝0．556），R+P 组、R+D 组、R+U 组在停药后 0．5 h、1 h和2 h机械性痛阈值显著低于术前基础痛阈值，差异有统计学意义（P＝0．000），其中停药后1 h痛觉阈值降至最低（P＝0．000），术后24 h组痛阈值恢复至基础水平．四组间在T0和T4时点痛阈值组间比较，差异无统计学意义（P＞0．05），在 T1、T2、T3 时点，R+P组、R+D组及R+U三组机械性痛阈值低于C组相应时点机械性痛阈值，差异有统计学意义（P＝0．000），而R+P组、R+D组及R+U三组间机械性痛阈比较，差异无统计学意义（P＞0．05，表 2）．

表2 各组大鼠机械性痛阈值的变化情况比较 （±s，n＝8）

表2 各组大鼠机械性痛阈值的变化情况比较 （±s，n＝8）

aP＜0．05 vs C 组；cP＜0．05 vs本组 T0．

机械性痛觉阈值（g）组别T0 T1 T2 T3 T4 C 107．6±11．8 106．5±10．9 103．7±11．1 109．4±14．7 107．8±12．8 R+P 103．8±8．4 87．5±11．9ac 80．4±8．3ac 88．9±10．2ac109．1±12．6 R+D 109．2±10．9 89．9±7．9ac 81．3±7．5ac 93．4±11．1ac111．3±11．4 R+U 106．6±8．6 88．8±9．5ac 79．3±6．9ac 94．5±14．3ac107．4±11．3

2．3 大鼠脊髓p-ERK阳性神经元的变化情况比较

各组高倍镜视野内可均可见少量p-ERK阳性细胞（图1）．各组间阳性细胞数目比较，差异无统计学意义（P＝0．142，表 3）．

图1 大鼠脊髓p-ERK阳性神经元

表3 大鼠脊髓p-ERK阳性细胞数目比较 （±s，n＝4）

表3 大鼠脊髓p-ERK阳性细胞数目比较 （±s，n＝4）

组别 p-ERK阳性细胞计数C 3．83±0．79 R+P 4．16±0．88 R+D 4．50±0．79 R+U 3．17±0．58

3 讨论

本研究发现，大鼠持续输注瑞芬太尼4 h停药后，痛觉敏感性降低，停药后1 h降至最低，停药后24 h逐渐恢复至基础水平，表明瑞芬太尼输注后可导致大鼠的痛觉过敏，与相关临床研究结果一致［6-8］．Laulin等［9］发现，大鼠皮下注射芬太尼，停药后3 h出现痛觉过敏，停药后4～5 h痛觉阈值降至最低．本研究中瑞芬太尼停药后0．5 h即表现出痛觉过敏，瑞芬太尼出现痛觉过敏较芬太尼早，与其药物性质有关，瑞芬太尼通过血浆内非特异性脂酶水解，停药后血浆内药物迅速代谢，很快出现痛觉过敏，而芬太尼代谢时间明显长于瑞芬太尼，其停药后出现痛觉过敏较晚．瑞芬太尼在临床应用剂量为0．1～0．4 μg·min-1·kg-1，人类药物等效剂量大约为大鼠的剂量×0．16，参照相关文献［10-11］，本研究瑞芬太尼的剂量为 1．0 μg·min-1·kg-1，相当于临床上0．15 μg·min-1·kg-1的剂量．

ERK属于丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族中的一员，将细胞外信号传递入细胞核内，引起细胞内特异蛋白的表达谱变化，从而影响细胞命运．磷酸化的ERK能产生翻译后的调节作用，通过直接或间接磷酸化一些关键结构如受体、离子通道、激酶，从而调节膜兴奋性和突触后可塑性变化．在多种疼痛模型研究［12］中发现，ERK通路参与脊髓水平伤害性信号调制和中枢敏感化的形成．本研究中发现鞘内U1026（ERK上游MEK的抑制剂）对瑞芬太尼引起的痛觉过敏无明显抑制作用，且脊髓中p-ERK阳性细胞未见明显变化．表明脊髓ERK可能与瑞芬太尼引起的痛觉过敏无直接相关性，可能原因如下：①瑞芬太尼引起痛觉过敏主要作用部位可能在脊髓上，脊髓虽为痛觉敏感化的关键部位，但瑞芬太尼引起的痛觉过敏可能作用于其他中枢区域［13］．吗啡耐受形成与脑内 ERK 路径有关［14］，阿片受体激动剂可使培养纹状体细胞内p-ERK阳性细胞增加［15］．②可能与本研究中瑞芬太尼输注的剂量和时间有关，输注剂量太小，作用时间太短，不足以激活脊髓ERK路径．长期应用吗啡可导致脊髓p-ERK阳性细胞增加［16］，与阿片类药物长期应用引起的耐受和成瘾与ERK路径有关，是否多次大剂量使用瑞芬太尼可激活脊髓ERK路径仍需研究．③虽然离体实验中发现阿片受体激动剂可激活多种培养细胞上的ERK路径［17］，且可被阿片受体拮抗剂纳洛酮阻断，但在体实验研究不同于离体实验．

本研究表明，瑞芬太尼4 h持续输注，停药后可引起大鼠痛觉过敏．鞘内注射U1026对瑞芬太尼引起的痛觉过敏无影响，脊髓p-ERK阳性细胞数目无变化，瑞芬太尼输注后大鼠的痛觉过敏可能与脊髓ERK活化无关．

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The role of activation of ERK in spinal cord on remifentanil-induced hyperalgesia in rats

LOU Ying-Ying1， LIU Yue2， LEI Hong-Yi2， JI Shu-Feng21Department of Anesthesiology，Traditional Chinese Medicine Hospital of Zhongshan， Zhongshan 528400， China；2Zhujiang Hospital， Southern Medical University， Guangzhou 510282， China

AIM： To evaluate the role of activation of ERK in spinal cord on remifentanil-induced hyperalgesia in rats．METHODS：Thirty-two adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into 4 groups， with 8 rats in each group．C group was given intravenous injection of normal saline （1．5 mL·h-1） after intrathecal injection of PBS solution （20 μL） for 4 h．R+P group was given injection of remifentanil（1 μg·min-1·kg-1） for 4 h after intrathecal injection of PBS solution （20 μL）．R+D group was given intravenous injection of remifentanil after intrathecal injection of DMSO solution （10 μL）．R+U group was given continuous intravenous injection of remifentanil （1 μg·min-1·kg-1）for 4 h after intrathecal injection of U1026 solution （10 μL）．The mechanical hyperalgesia threshold was evaluated by the paw pressure test before venipuncture （T0）， before administration（Tc），0．5 h， 1 h， 2 h and 24 h after drug withdrawal（T1～T4， respectively）．The p-ERK positive cells in spinal cord were examined after drug withdrawal 1 h with immunohistochemistry．RESULTS：At 0．5 h， 1 h， 2 h after drug withdrawal， the paw-pressure threshold of R+P group，R+D group and R+U group were significantly decreased compared with those of C group and baseline（P＜0．001）．The mechanical pain threshold of R+P group， R+D group and R+U group were minimized after drug withdrawal 1 h．There were no significant differences of the paw-pressure threshold in 24 h after treatment among four groups．There were no statistically significant differences on the numbers of p-ERK positive cells in rat spinal cord among four groups（P＞0．05）．CONCLUSION：The sensitivity to pain of rats was increased after continuous intravenous injection of remifentanil for 4 h，therefore activation of ERK in spinal cord may be unrelated to remifentanil-induced hyperalgesia．

remifentanil； hyperalgesia； spinal cord

R965

A

2095-6894（2017）11-31-04

2017-03-04；接受日期：2017-03-24

广东省临床用药研究基金（2015ZT15）；广东省自然科学基金面上项目（2015A030313296）

楼莹莹．E-mail：32376130＠ qq．com

纪术峰．硕士，副主任医师．E-mail：jishu_feng＠ 163．com