HPLC-MS法测定药品含量的不确定度评定

秦雯雯，王庆伟，赵 波，张生萍，许晓辉

（1甘肃省药品检验研究院，甘肃兰州730070；2第四军医大学唐都医院药剂科，陕西西安710038；3兰州市食品药品检验所，甘肃兰州 730000）

HPLC-MS法测定药品含量的不确定度评定

秦雯雯1，王庆伟2，赵 波3，张生萍3，许晓辉3

（1甘肃省药品检验研究院，甘肃兰州730070；2第四军医大学唐都医院药剂科，陕西西安710038；3兰州市食品药品检验所，甘肃兰州 730000）

不确定度评定是评价测定结果准确有效与否的量化指标，本研究介绍了HPLC-MS法测定药品含量的不确定来源、不确定评定程序以及HPLC-MS法测定药品含量的不确定度应用进展，为HPLC-MS法在药品定量过程中进行不确定度的测定评估提供参考，从而保证测定结果的准确可靠．

HPLC-MS；不确定度；评定

0 引言

液质联用法（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）分析样品不需要繁琐的前处理，同时能够得到化合物的保留时间、分子量、碎片结构特征等信息，具有高效快速灵敏的优点，适合分析含量少、无紫外吸收的化合物．HPLC-MS法作为标准检测方法已应用到药品定性定量分析中，主要用于成分复杂，分离困难的中药含量测定、化学药物复合制剂主要成分定量及杂质测定、多肽药物定量及杂质测定、中成药中的化学药品非法添加的分析、原研药物与仿制药生物等效性分析等方面［1-9］．在测定过程中，由于受测定所用仪器的限制、测定方法的不完善、分析操作和测定环境的变化、测定人员本身的技术水平或经验的影响，被测定的真值不可能通过测定得到，而借助测定不确定度可以了解到被测定的值处于何种范围内，测定不确定度就是表征合理地赋予测定之值的分散性与测定结果相联系的系数，因此测定不确定度是质量控制部门重点管控范畴，为了更加准确科学地应用HPLC-MS法进行药品定量，测定不确定度被引入到HPLC-MS法测定过程受控检验、检验检测方法验证评价、测定结果与参照值一致性检验、不同测定方法之间比对等方面，其中扩展不确定度用于测定审核结果判定，这将有效地提高含量测定结果的准确性和科学性．

1 HPLC-MS法测定药品含量的不确定度来源

常见的测定不确定度一般来源有：被测对象、测定仪器、测定环境、测定人员和测定方法等．结合HPLC-MS法测定样品的处理过程和测定过程，分析不确定度主要有以下来源：称样用到电子分析天平和样品取样的随机性所存在的随机误差构成了样品称样过程中的不确定度；用来校准样品浓度的标准拟合曲线的不确定度；容量瓶定容读取的体积引入的误差；测定样品在提取、浓缩、转移过程中所引入的误差；标准物质所产生的不确定度；标准溶液配制所产生的不确定度；仪器的重复性和精密度引起的不确定度；仪器校准及测定过程引入的不确定度；测定方法引入的不确定度．主要的测定不确定来源总结见图 1［10］．

图1 HPLC-MS法测定药品含量不确定的来源示意图

2 HPLC-MS法测定药品含量的不确定度评定

测定不确定度来源于测定过程和样品处理过程，因此测定不确定度评定也紧扣这些过程，以实验过程可能带入的不确定度的各环节作为分量，通过比较各分量的不确定度的大小，可以量化各分量对检测结果准确性的影响程度，通过对各分量的不确定度评定，得到合成标准不确定度，再由合成标准不确定度乘以包含因子k得到扩展不确定度，不确定度评定的一般步骤见图 2［11］．

图2 测定不确定度评定的一般步骤

HPLC-MS法测定药品含量的不确定度评定具体步骤如下：①理解描述所有对测定结果有影响的影响量．如样品及标准物质的称样、容量瓶定容、取样过滤、标准物质绝对含量、标准工作溶液浓度、液质联用仪器等引入的不确定度；②建立数学模型．被测量y由N 个输入量 x1，x2，x3，…，xN通过函数关系来确定，即 y＝f（x1，x2，x3，…， xN），在这里测定某种药品含量按如下公式计算，X＝（C×V）／（m×fr），X 为被测定某种药品含量，μg／kg；C为在标准曲线上读取的样品溶液浓度，μg／L；m为样品称样量，g；V为定容体积，mL；fr为回收率；③标准不确定度分量的评定．要对每一个不确定来源通过测定或估值量化，估计每一个分量对合成不确定度的贡献，排除不重要的分量，可通过实验进行定量、使用标准物质定量、对结果进行估值、仪器校准／检定证书提供的值、基于判断进行定量等方法进行量化，标准不确定度是以标准偏差表示的测定不确定度；④合成不确定度的计算．被测定的合成不确定度等于各分量标准不确定度的平方和的平方根，合成不确定度是测定结果标准偏差的估计值，它表征了测定结果的分散性；⑤扩展不确定度．根据要求的包含概率选定因子k，包含因子k与合成不确定度相乘得到扩展不确定度，扩展不确定度是指合理赋值的被测定量之值的分散区间理应包含全部的测定值；⑥测定不确定度的符合性判断．如图3所示［12］，U为扩展不确定度，2T为上下限．

图3 测定不确定度符合性与不符合性判断示意图

3 HPLC-MS法测定药品含量的不确定度评定应用进展

HPLC-MS法测定药品含量存在误差，不确定度是评估测定结果质量的指标，不确定度愈小，表明测定结果与真值越接近，表示测定结果越准确．HPLC-MS法在中药定量控制方面主要应用于成分复杂，分离困难的中药含量测定，不确定度评定能够为应用HPLC-MS法进行中药定量的准确性提供量化指标，进一步保证分析结果准确可靠．陈建琴［13］对HPLC-MS测定川楝子中川楝素含量进行不确定度评估，评估结果显示，液质联用仪进样重复性是测量结果不确定度的主要来源，标准溶液浓度对结果也有影响，但是影响不大，而供试品的定容体积、取样量、相对取样量对结果的影响可以忽略不计．化学药物血药浓度检测是进行安全有效用药的保证，评估HPLCMS法测定结果的不确定度能够系统考察检测过程及结果的误差范围．王长陆等［14］分析了HPLC-MS／MS法测定人血浆中6-MMP含量的不确定度来源，计算并进行合成不确定度和扩展不确定度，评估了HPLCMS／MS法测定6-MMP含量的不确定度，结果表明，不确定度在低浓度时主要由基质效应、回收率、生物样品配制引入，而在高浓度时主要由回收率和生物样品配制引入．在应用HPLC-MS法测定中成药的非法添加的不确定度评定方面，龙凌云等［15］通过建立数学模型，分析不确定度来源，对各个不确定度分量进行评估、计算，由此计算合成不确定度和扩展不确定度评估了HPLC-MS法测定中成药中二甲双胍的不确定度，该方法可用于评估测定结果的准确有效性．武利庆等［16］对直接流动注射电喷雾质谱法和液质联用电喷雾法测定牛血清蛋白相对分子质量的测定不确定度进行了比对，结果表明，液质联用法不确定度低，测定结果的准确性高，这是由于测定样品经过液质联用的色谱柱的分离和脱盐，杂质对分子量测定的影响变小．总的来说，HPLC-MS法测定药品含量的不确定度评定可以有效控制测定过程中的误差风险，当然HPLC-MS法测定目标物不同、仪器参数不同、被测定物的重现性不同、甚至不同测定时间都会产生不同的误差，因此不确定度的评定是一件比较困难的事情．

4 结语

HPLC-MS法越来越多地被应用于药品定性、定量分析中，其作为标准检测方法已被引入国家药典标准中，测定过程与前处理过程往往会对其测定结果造成影响，导致结果偏离准确有效，因此进行不确定度评估是验证测定结果准确有效的方法．由一些HPLC-MS定量不确定度评定的文献报道［13-17］可以看出，测定的重复性和标准曲线拟合对不确定度影响最大，这提示我们样品与对照必须同条件同法处理，同时测定，另外要保证样品溶液浓度落在标准曲线的中间位置以减少对测定结果不确定度的影响，同时由于基质效应有时还需要进行回收率验证．这给我们的提示是，在定量分析过程中，重点关注前处理、天平、移液管、定容、对照、仪器等引入的不确定度，根据称样的要求选择合适的天平，定期对标准物质、仪器设备进行期间核查，保证测定结果始终能够保持良好的准确度和重现性．

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Uncertainty evaluation on determination of drug content by HPLC-MS

QIN Wen-Wen1， WANG Qing-Wei2， ZHAO Bo3， ZHANG Sheng-Ping3，XU Xiao-Hui31Gansu Institute for Drug Control， Lanzhou 730070， China；2Department of Pharmacy of Tangdu Hospital，The Fourth Military Medical University， Xi'an 710038， China；3Lanzhou Institute for Food and Drug Control， Lanzhou 730000， China

Uncertainty evaluation is to evaluate the validity of measurement results．In this paper， the source of uncertainty for determination of drug content by HPLC-MS，the assessment procedures of uncertainty for determination of drug content by HPLCMS，and application progress of uncertainty for determination of drug content by HPLC-MS in quantitative detection field were introduced，it provides reference for evaluation of uncertainty for determination of drug content by HPLC-MS during drug quantitative process， so as to ensure the accuracy of the measurement results．

HPLC-MS； uncertainty； evaluation

R917

A

2095-6894（2017）11-90-03

2017-03-12；接受日期：2017-04-02

国家自然科学基金（81272175）

秦雯雯．硕士．研究方向：药品检验方法．

E-mail：qinwenwen1989＠ 163．com

许晓辉．硕士．研究方向：药品检验方法．

E-mail：aiwosuozuo＠ 163．com