基于星点设计-效应面法优化化学药物复方制剂HPLC分析方法

许晓辉，杜 清，徐 媛，秦雯雯，赵 波，曹恩君，张生萍

（1兰州市食品药品检验所，甘肃兰州730000；2青海民族大学药学院，青海 西宁 810007；3第四军医大学唐都医院药剂科，陕西西安710038；4甘肃省药品检验研究院，甘肃兰州730070；5庆阳市药品检验检测中心，甘肃 庆阳745000）

基于星点设计-效应面法优化化学药物复方制剂HPLC分析方法

许晓辉1，杜 清2，徐 媛3，秦雯雯4，赵 波1，曹恩君5，张生萍1

（1兰州市食品药品检验所，甘肃兰州730000；2青海民族大学药学院，青海 西宁 810007；3第四军医大学唐都医院药剂科，陕西西安710038；4甘肃省药品检验研究院，甘肃兰州730070；5庆阳市药品检验检测中心，甘肃 庆阳745000）

对药品进行质量控制是保证药品安全有效的基础和前提，而HPLC定量分析方法研究是药品质量控制分析的主要内容．星点设计-效应面法使用方便，优化HPLC分析方法预测性良好．本文探讨了星点设计-效应面法优化化学药物复方制剂HPLC分析方法的研究思路与应用，为进一步研究化学药物复方制剂精准HPLC分析方法提供参考．

星点设计-效应面法；化学药物复方制剂；HPLC分析方法

0 引言

在化学药物复方制剂质量控制HPLC分析方法研究中，常需面临的问题是分析方法中多个条件因素选择的非最佳化对分析结果的准确度造成的影响，因此优化分析方法，找到最佳分析条件，使得结果准确、稳定非常重要．当考察分析的因素水平数较少时可选择析因设计法进行优化，而考察分析的因素水平数较多时则需选择实验设计优化法．实验设计优化法的优点是实验精度高，实验次数较少．目前，均匀设计和正交试验设计方法是国内用得比较成熟的实验设计方法，虽然这两种方法基本可以满足一般实验的要求，在实验条件优化时能够取得较佳实验条件，但是它们在应用中还存在不足，主要有精度不够，各因素间的交互作用不能被灵敏地考察，建立的数学模型预测性较差，无法精确找到最佳点，优化所得的试验取值仅仅是接近最佳取值．而星点设计是效应曲面中最常用的二阶设计，是由二水平析因设计加轴点及中心点组成，是集数学和统计学方法于一体，并且使用方便的试验设计优化方法，具有试验精度高、试验次数少等特点，其已应用于优化化学药物复方制剂HPLC分析方法领域．

1 星点设计-效应面法

1．1 基本术语 自变量用 x1，x2，．．．，xn表示，其为所考察的因素．效应变量用y表示，其为考察指标结果．星点设计-效应面优化法主要用于研究考察因素自变量对考察指标效应变量的交互作用关系，并对其研究优化，考察因素自变量要求必须连续，同时要能够准确控制．效应面函数与效应面可用函数y＝f（x1，x2，…，xn）+ε表示 （ε为噪音即偶然误差），其中f为效应面函数，该函数所代表的空间曲面称为效应面．效应面函数与效应面代表考察因素与效应之间的关系．模拟效应面函数与模拟效应面在实践操作中，一般用近似函数 y＝ f'（x1，x2，…，xn） +ε 估计真实函数 f，则f'称为模拟效应面函数，f'函数所代表的空间曲面为模拟效应面，也是实际操作优化的效应面．优化的效应面可用二维等高线图或者三维效应面图表示．可以直观地从描绘出的效应曲面上找到自变量取不同值时相对应的效应值，反过来也可以根据描绘出的效应面上一定效应值找出相对应的自变量取值，即在效应面上定位出较佳效应面值范围后可相对应求出自变量取值所代表的较佳实验条件［1-2］．

1．2 基本原理 星点设计-效应面优化法的基本原理是通过描绘与考察因素交互相对应的效应面，从所得效应面上选定最佳的效应区范围，根据最佳效应区再回推出考察自变量的取值范围即最佳实验条件．星点设计-效应面优化法是通过拟合效应变量对考察因素变量的效应面，在这里，效应对因素的真实效应面只是假想的，即函数f不可能用数学模型表述，但可以用某一数学模型f'近似地模拟函数f，根据该模型就可以描绘出效应面，从效应面上就可以选择最优的效应域，依据模拟效应面函数f'求得自变量的取值范围即最佳实验条件．而数学模型函数f与f'的近似程度直接关系到真实函数与模拟函数所代表效应面的近似程度与优化选定条件的准确度．星点设计-效应面法作为一种集数学与统计学方法于一体的实验设计优化方法，其优化化学药物复方制剂HPLC分析方法基本策略流程如图1所示［3］．

图1 星点设计-效应面法优化化学药物复方制剂HPLC分析方法流程图

2 基于星点设计-效应面法优化化学药物复方制剂HPLC分析方法的研究思路

2．1 与各国药典收载及文献报道的该制剂HPLC方法进行比较 在运用星点设计-效应面法优化化学药物复方制剂HPLC分析方法优化具体药物之前，应充分掌握该制剂的理化性质及特点，比如主药分子量大小、结构性质、脂水分配系数、溶解度、极性大小等．同时还应考虑制剂组分、稳定性、杂质、辅料等因素结合具体制剂的特点和实际情况．另外，应掌握影响HPLC精准分析的关键自变量因素．而通过与各国药典收载的该化学药物制剂HPLC方法进行比较，是获得影响该药物制剂HPLC精准分析的关键自变量因素的主要途径，通过对比各国药典中该药物制剂HPLC分析方法中的流动相、流速、色谱柱、柱温、系统适用性、检测波长、供试品溶液的配置、进样量等的异同，确定影响精准分析的关键自变量因素；没有药典标准的，通过查阅文献专利，与已有分析方法进行比较，确立主要自变量因素．

2．2 考察因素水平范围的确立 通过文献调研及实践经验确定了HPLC分析方法关键自变量因素的范围，如采用特定比例的洗脱液，选用不同类型色谱柱、检测波长、流速、线性时间梯度、柱温、缓冲盐等作为考察变量，可从任一考察因素水平着手，这时可能离较优区较远所对应效应面的弯曲度较小，此时可用较简单的线性模型模拟采用最速下降法向较优区逐步靠近．随着进入较优区后，对应的面弯曲度会逐渐增大，此时线性模型已不再适合拟合，则需用两次以上的非线性数学模型拟合，选取该处因素水平范围以获得较佳优化效果．循序渐进法的优点是确定水平范围时比较准确，不足是实验操作繁琐、耗时长．有时，研究者也结合预试验的结果凭经验直接确定考察因素水平的范围，一般所选择的范围为实验所允许的最大可能取值范围，所得结果也表现良好．一般情况下考察因素水平范围的确立是采用单因素考察分析法，该方法是将其他因素固定为常值，观察某个考察因素对观察指标的影响，从而确立考察因素水平．主要因素水平范围的确定，为星点设计提供依据．

2．3 效应面设计 在对考察因素变量分析确立的基础上，利用星点设计-效应面法对关键显著考察因素作进一步取值优化．星点设计是在二水平析因设计基础上加上极值点与中心点构成的多因素多水平的实验设计．星点设计表由三部分组成：2k或2k×1／2析因设计、极值点和中心点．由于二水平的析因设计只能用作线性考察，因此需再加上第二部分极值点，这样才适合于非线性拟合．如果以坐标表示，极值点表示为（±λ，0，…，0），（0，±λ，…，0），…， （0，0，…，±λ），其在坐标轴上的位置称为星点（也称轴点），星点的组数与因素数相同．中心点在实验表中是以代码的形式编排的，一般水平取值为0，±1，±λ，其中 0为中值，λ 为极值，λ＝（F）1／4，F 为析因设计部分实验次数，F＝k2（k 为因素数）或 F＝k2×1／2，通常实验时再把代码转化为实际操作值．在确定了各因素水平的极大值（+λ）和极小值（-λ）后，就可根据水平代码分别求出+1，0，-1所代表的物理量值．±1，0水平的编排遵循任意两个物理量之间的差值与对应代码之间差值成等比的原则，如图2所示，其为k＝2（a）和k＝3（b）的星点设计试验分布图［4］．

2．4 多元线性或非线性拟合 按照星点试验表的设计，控制试验误差在最小范围内，一般以两峰分离度之和、归一化分离因子、色谱分层响应效能等作为评价指标，对确定的各主要因素进行寻优，并对试验结果进行拟合，分别对各因素（自变量）进行多元线性回归和二项式拟合．对模型拟合优劣程度用方差分析进行判断，有时，尽管模型通过检验，但拟合度不好，预测性可能不佳，失拟性显著．效应与因素之间的关系一般是非线性，对应的效应面是弯曲的，然而当考察多个因素对结果的影响时，由于各个考察因素之间的交互关联作用，使得效应面的弯曲度更大，这时则需使用二次以上的多元非线性拟合．

图2 星点设计的分布图

2．5 模型优化与预测 目前，处理数据的统计软件有SAS、SPSS等，画三维效应面立体图的软件有Origin、Matlab和Design Expert．依据建立的数学模型描绘出效应面，在效应面的最优区域直接读取相对应的较佳HPLC色谱条件范围．对于每一个效应最佳区域均可得到一个较佳实验条件范围，同时，为了进一步缩小较佳实验条件范围，也可以把几个效应面最优区域所选定的较佳条件通过叠加．当指标较多时，每个指标优选的条件可能相互矛盾，导致每个因素的较佳条件无重叠区，此时则需进行归一化，即用求总评“归一值”进行综合评价，总评“归一值”不但能将所有指标均能量化体现，反映出总体效应结果，而且能够客观综合所有指标，使模型预测值与真实值更好、更接近．根据二项式绘制的效应面分析图反映了因素之间的交互作用，曲面曲率越大，说明两因素之间交互作用越大，其揭示了交联多因素变量对效应结果影响．

3 基于星点设计-效应面法优化化学药物复方制剂HPLC分析方法的应用进展

化学药物复方制剂是由两种或两种以上药物组成，涉及的药物种类及其杂质来源复杂多样．目前主药含量测定、杂质定量主要采用HPLC法，然而，在实际定量过程中，由于复方制剂各主药含量、稳定性不同，杂质多样，辅料影响，同时各化合物在HPLC分析中的响应值不同，因此建立一种有效精准的含量测定、有关物质定量的HPLC分析方法进行化学药物复方制剂质量控制显得很有必要［5-6］．而星点设计-效应面法在应用于化学药物复方制剂HPLC方法优化中，是通过数据模型对影响因素与响应指标进行拟合，评价模型．该方法提高了实验精度，使模型预测值更接近真值．Topkafa等［7］基于星点设计-效应面法优化了RP-HPLC分离和测定片剂中的乙酰氨基酚和咖啡因方法中的关键因素，通过二次式模型、回归分析、满意度函数法、三维效应面图分析优化了流动相比例、流速、柱温，获得了最佳测定条件，最佳色谱条件是乙腈 ∶水＝ 21．69 ∶78．31，流速：1．5 mL／min，柱温：15℃，乙酰氨基酚线性范围为2～160 mg／mL（R2＝0．999），咖啡因线性范围为 2 mg／mL～9．9 mg／mL（R2＝0．991），两者的回收率分别为 95．90%与 95．68%．Elkhoudary等［8］开发了一种简单、灵敏、快速和精确的用于同时测定片剂中的甲硝哒唑、螺旋霉素、二氯散糠酸酯、氯碘羟喹的RP-HPLC-DAD方法．作者首先考察了关键因素，确定筛选了5个主要因素，如柱温、pH、磷酸盐缓冲液浓度、流速以及流动相中甲醇比例，然后通过星点设计-效应面法优化获得了最佳色谱条件，该条件线性良好，相关系数达到0．9999．以预测指数为指标评价了模型的预测性，结果表明优化获得的色谱条件预测性良好．Ganorkar等［9］通过星点设计-效应面法设计优化了一种简单、快速、灵敏、稳定性好的RP-HPLC-PDA分析方法，用于定量抗哮喘药齐留通．Kalariya等［3］设计了一种RP-HPLC分析方法用于测定滴眼剂中喹诺酮类抗菌药莫西沙星和非甾体类抗炎药酮咯酸氨丁三醇含量，三个自变量因素（流动相中甲醇比例、缓冲液pH、流速）被用于建立数学模型，利用效应面分析研究变量因素之间的交互关系，获得的方法优化了酮咯酸氨丁三醇保留最后洗脱峰的时间、莫西沙星拖尾的问题．

4 结语

星点设计-效应面法适用于多因素多水平的试验，主要考察自变量对效应的作用，通过描绘效应对考察因素的效应面，从效应面上选择最佳的效应区．效应与因素之间的关系是线性关系或者非线性关系，线性关系为平面，非线性关系为曲面．在效应面，接近最佳区域的面的弯曲度越大，非线性关系居多，远离最佳区域的面弯曲度小，接近线性关系．星点设计-效应面法复合相关系数较高，预测值更接近真实值，而且结果明了直观，提高了实验精密度及优化效果．星点设计-效应面法不仅应用于普通药物剂型处方条件的筛选［10］，而且应用于新型给药系统处方筛选及工艺条件优化［11-17］及化学药物合成条件的筛选优化［18-19］．近年来，星点设计-效应面法应用于药物分析方法优化也较多，在化学药物复方制剂HPLC分析方法优化中，应用星点设计-效应面法能够探索准确有效的色谱条件，实现化学药物复方制剂HPLC方法研究的精准，即预测值靠近真实值．因此，星点设计-效应面法在研究化学药物复方制剂HPLC分析方法方面具有较高的应用价值．

［1］刘艳杰，项荣武．星点设计效应面法在药学试验设计中的应用［J］．中国现代应用药学杂志，2007，24（6）：455-457．

［2］吴 伟，崔光华．星点设计-效应面优化法及其在药学中的应用［J］．国外医学药学分册，2000，27（5）：292-298．

［3］ Kalariya PD， Namdev D， Srinivas R， et al．Application of experimental design and response surface technique for selecting the optimum RP-HPLC conditions for the determination of moxifloxacin HCl and ketorolac tromethamine in eye drops［J］．J Saudi Chem Soc，2014，54（S1）：1-10．

［4］ Saini R， Kumar P．Optimization of chlorpyrifos degradation by Fenton oxidation using CCD and ANFIS computing technique ［J］．J Environ Chem Engine，2016，4（3）：2952-2963．

［5］张玉琥．化学药物复方制剂杂质研究的特点及基本思路［J］．中国新药杂志，2006，15（16）： 1327-1329．

［6］练富林，李洪雪，施月芹，等．化学药物复方制剂中杂质的检查与控制［J］．药学进展，2009，33（3）：112-118．

［7］ Topkafa M， Ayyildiz HF， Memon FN， et al．New potential humic acid stationary phase toward drug components：development of a chemometric-assisted RP-HPLC method for the determination of paracetamol and caffeine in tablet formulations［J］．J Sep Sci，2016，39（13）：2451-2458．

［8］ Elkhoudary MM，Abdel Salam RA，Hadad GM．Development and optimization of HPLC analysis of metronidazole， diloxanide， spiramycin and cliquinol in pharmaceutical dosage forms using experimental design［J］．J Chromatogr Sci，2016，54（10）：1701-1712．

［9］ Ganorkar SB，Dhumal DM，Shirkhedkar AA．Development and validation of simple RP-HPLC-PDA analytical protocol for zileuton assisted with design of experiments for robustness determination［J］．Arab J Chem，2017，10（2）：273-282．

［10］李正刚，杨 俊，谢 俊，等．星点设计-效应面法优化盐酸美金刚缓释微丸处方［J］．药学与临床研究，2017，25（3）：190-194．

［11］胡 静，周 卫．星点设计-效应面法对帕利哌酮渗透泵控释片处方的优化［J］．中国医院药学杂志，2016，36（16）：1369-1374．

［12］马 薇，吕竹芬，陈燕忠．星点设计-效应面法优化普仑司特自微乳给药系统［J］．中国新药杂志，2016，25（10）：1153-1159．

［13］李美云，雷小小，周 江，等．星点设计-效应面法优化莲心总碱固体分散体渗透泵控释片处方［J］．中草药，2016，47（18）：3204-3210．

［14］夏美华，张 婧，李 翔，等．星点设计-效应面法优化波生坦渗透泵片处方［J］．江西中医药大学学报，2016，28（5）：83-87．

［15］田 霞，范云周，孙 媛，等．星点设计-效应面法优化蒿甲醚自微乳释药系统［J］．国际药学研究杂志，2016，43（5）：966-970．

［16］赵宁民，张红艳，王豫辉．莫西沙星聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒的性质及制备优化［J］．中国医院药学杂志，2009，29（10）：808-811．

［17］李 翔，张 婧，王东凯，等．叶酸受体靶向两亲性嵌段共聚物修饰多烯紫杉醇脂质体的制备及体外性质考察［J］．药学学报，2012，47（9）：1219-1226．

［18］冯 悦，陈英杰，彭 俊，等．星点设计-效应面优化法优化2-（3-羟基-1-金刚烷基）-2-乙醛酸的合成工艺［J］．化学研究与应用，2013，25（2）：194-199．

［19］甘 润，邓 瑜，李依宁，等．维格列汀主要相关物质的合成及其优化［J］．国际药学研究杂志，2016，43（2）：325-329．

Optimization of HPLC analysis method for compound preparation ofchemicaldrugs based on central composite design-response surface method

XU Xiao-Hui1， DU Qing2， XU Yuan3， QIN Wen-Wen4， Zhao Bo1， CAO En-Jun5， ZHANG Sheng-Ping11Lanzhou Institutes for Food and Drug Control， Lanzhou 730000，China；2College of Pharmacy， Qinghai Nationalities University，Xining 810007， China；3Department of Pharmacy of Tangdu Hospital， The Fourth Military Medical University， Xi'an 710038，China；4Gansu Institute for Drug Control， Lanzhou 730070，China；5Qingyang Institute for Drug Control， Qingyang 745000，China

The basis and precondition for ensuring the safety and efficacy of drug is to control the quality of drug，in which the quantitative analytical method of HPLC is the main content．Central composite design-response surface method is convenient，and it has good predictability．In this paper， we discussed the research idea and application on optimization of HPLC analysis method for compound preparation of chemical drugs based on central composite design-response surface method，and it is expected to provide the reference for further research aiming to find the accurate HPLC analysis method for studying compound preparation of chemical drugs．

central composite design-response surface method；chemical compound preparation；HPLC analysis method

R917

A

2095-6894（2017）11-82-04

2017-01-20；接受日期：2017-02-05

国家自然科学基金（8160313）

许晓辉．硕士．研究方向：药品检验方法研究．

E-mail：aiwosuozuo＠ 163．com

张生萍．高级工程师．研究方向：药品检验方法．

E-mail：1043577029＠ qq．com