4周有氧训练诱导AMPKα2对小鼠骨骼肌Nrf2-ARE结合活性的影响

罗 琳，何诗依，严 露，姬卫秀，张 缨

4周有氧训练诱导AMPKα2对小鼠骨骼肌Nrf2-ARE结合活性的影响

罗 琳1，2，何诗依1，严 露1，姬卫秀1，张 缨1

目的：探讨4周有氧训练诱导AMPKα2对小鼠骨骼肌Nrf2-ARE结合转录活性的影响及可能机制。方法： AMPKα2转基因（TG）小鼠及其野生型（WT），随机分为对照组和训练组，每组各10只。训练组每天进行坡度为0、速度为12 m/min的跑台训练、1 h/天、6天/周，持续4周。对照组不参与训练。最后一次跑台训练结束48 h后取材，测定骨骼肌Nrf2-ARE结合活性、抗氧化酶 mRNA和蛋白表达以及骨骼肌ROS含量。结果：4周有氧训练后：1）WT和TG小鼠骨骼肌ROS水平、Nrf2-ARE结合活性显著增加（P＜0.05）；与训练组WT鼠相比，训练组TG鼠骨骼肌ROS水平显著降低，Nrf2-ARE结合活性显著增加（P＜0.05）。2）训练组WT鼠骨骼肌HO-1 mRNA和训练组TG鼠骨骼肌（Gpx-1、NQO-1、HO-1、CAT ）mRNA表达显著增加（P＜0.05）。3）训练组WT鼠骨骼肌蛋白（CAT、SOD1、HO-1、GSR，P＜0.05）表达，训练组TG鼠骨骼肌蛋白（Gpx-1、CAT、SOD2、NQO-1，P＜0.05）和（GCLc、SOD1、HO-1、GSR，P＜0.01）表达显著增加；与训练组WT鼠相比，训练组TG鼠骨骼肌蛋白（Gpx-1、SOD1、SOD2、HO-1、GSR、NQO-1，P＜0.05） 和GCLc（P＜0.01）蛋白表达显著增加。结论：4周有氧训练可能诱导AMPKα2，促进Nrf2-ARE结合活性，进而增加抗氧化酶的蛋白表达，提高机体抗氧化能力。

AMPKα2；Nrf2；有氧训练；骨骼肌

腺苷酸激活蛋白激酶（Amp activated protein kinase，AMPK）在机体物质代谢及能量代谢中的作用已被充分证实［7］。然而，近年来有实验发现，AMPK不光参与细胞能量代谢调节，还可被氧化应激激活［8，9］，进而参与机体抗氧化物质的调节。

核因子 E2相关因子2（nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）是机体的重要核转录因子，对细胞内氧化还原状态敏感，能引起细胞内氧化还原状态发生改变的因素，如缺氧、炎症、运动等均可能导致Nrf2转录活性发生变化［8］。Nrf2可与靶基因DNA启动子上的抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）相互作用，启动下游包括过氧化氢酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxidase dismutase ，SOD）、NADPH醌氧化还原酶1（NADPH quinine oxidoreductase1，NQO1）、谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GST）、血红素加氧酶1（hemeoxygenase1，HO-1）、谷胱甘肽过氧化物酶 1（Glutathione peroxidase 1，Gpx-1）、谷胱甘肽还原酶（Glutathione reductase ，GSR）和氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基（Cysteine ligase catalytic subunit，GCLC）等一系列抗氧化酶和II相解毒酶基因的转录［9，10，16］。进而进一步提高机体的抗氧化能力。

以往研究发现，长期耐力训练可使Nrf2转录活性和表达量增加［6，21］。但在运动的过程中， AMPK是否参与Nrf2转录活性变化的调节，从目前文献所见，仍缺乏直接实验证据。因此，本研究通过野生型小鼠和AMPKα2转基因小鼠，观察4周有氧训练下骨骼肌Nrf2-ARE结合活性的变化。

1 材料与方法

1.1 实验对象及分组

健康2月龄AMPKα2转基因小鼠（TG鼠）以及野生型小鼠（WT鼠，两种鼠均属于C57BL/6J品系）各20只，分别随机分为对照组（Control group，C）和训练组（Trainning group，T），每组各10只。TG鼠由中国医学科学院实验动物研究所制备并繁育。WT鼠由北京维通利华公司提供。小鼠体重（18.42±1.96）g，按性别、鼠种分笼饲养，每笼3～4只。饲养环境温度20～25℃，相对湿度50%～70%，每天光照12 h。国家标准啮齿类动物饲料饲养 ，自由进食和饮水。

1.2 实验方案和取材

所有小鼠在北京体育大学动物房进行饲养和训练，训练组小鼠正式实验前3天每天安排适应性训练。正式实验为：1周6天，每天进行坡度为0、速度12 m/min、接近于75% V.O2max强度［4］的跑台有氧训练1 h，总共持续4周。训练组饲养及饮食条件与对照组一致。最后一次运动结束48 h后，采用脱颈法处死小鼠，迅速取小鼠小腿骨骼肌于－80 ℃冻存备用。

1.3 测定方法

1.3.1 骨骼肌活性氧（ROS）水平测定

取50 mg小腿骨骼肌组织，采用ROS试剂盒（GMS10016.3，GENMED），测定骨骼肌ROS水平，严格按照试剂盒说明书进行操作，使用多功能荧光酶标仪，对样品进行490/520 nm，RFU值检测，结果以测定孔RFU值－空白孔RFU值表示。

1.3.2 骨骼肌Nrf2-ARE结合活性测定

取50 mg小腿骨骼肌组织，采用Trans AM ® Nrf2试剂盒（Active Motif，美国），测定骨骼肌Nrf2-ARE结合活性，严格按照试剂盒说明书进行操作，利用比色法读取450 nm的OD值，结果以测定孔OD值－空白孔OD值表示。

1.3.3 RT-PCR法测定骨骼肌抗氧化酶mRNA表达

取小鼠小腿骨骼肌50 mg，使用 Trizol 试剂（Invitrogen）提取总RNA，以紫外分光光度计确定提取的总RNA纯度和浓度，采用RT-PCR试剂盒（Toyobo）和PCR扩增仪（MG96+/Y型，杭州朗基科学仪器有限公司）将RNA逆转录为cDNA，使用RT-PCR仪（7500，ABI公司）测定18 s rRNA 和各目标抗氧化酶mRNA〔引物QIAGEN：18srRNA（QT00157248）SOD1（QT00165039），SOD2（QT00161707），GCLc（QT00130543），CAT（QT010558106），GSR（QT01758232），GPX1（QT01195936），NQO-1（QT00094367），HO-1（QT00159915），SYBR染料（SYBR Green Realtime PCR Master Mix，TOYOBO公司）〕。使用该仪器自带软件读取目的基因荧光定量CT值。目的基因结果以比较CT法相对定量表示。计算公式为［16］：目的基因=2-△△CT。

1.3.4 Western Blot法测定骨骼肌抗氧化酶蛋白表达

取小鼠小腿骨骼肌100 mg，使用1 mL蛋白裂解液，剪碎，超声匀浆，冰上静置10 min，4 ℃ 12 000 r/min离心5 min，提取上清液。BCA试剂盒（Pierce公司）测定蛋白浓度。根据蛋白浓度及上样蛋白量20 μg计算上样的体积。采用Bolt 4%～12% Bis-Tris Plus凝胶（Life Technologies）和Mops缓冲液进行蛋白电泳，通过iBlot Gel Transfer System（Invitrogen）将凝胶内蛋白转印到NC膜上。NC膜用5%牛奶封闭1 h，加入一抗［抗体信息如下：β-actin（1：1 000，Santa sc 47778）、AMPKα2 （1：1 500，Santa sc19 129）HO-1（1：1 000，Abcam ab13 248）、GSR（1：1 000，Santa sc133245）、CAT（1：500，Santa sc50508）、NQO1（1：500，Santa sc16464）、GCLc（1：500，Santa sc2255）、SOD2（1：500，Santa sc30080）、SOD1（1：500，Santa sc11407）、GPX-1（1：500，Santa sc22145）］过夜，二抗室温孵育1 h。使用化学发光液（Thermo公司）在成像仪（BIO-RAD公司）成像，Image Lab4.1软件读取条带积分灰度值 ，结果用目的蛋白积分灰度值与内参积分灰度值的比值/对照目的蛋白积分灰度值与内参积分灰度值比值表示。

1.4 统计学分析

所有数据以平均数±标准误表示，使用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，采用双因素方差分析。差异具有显著性，P＜0.05；差异具有非常显著性，P＜0.01。

2 结果

2.1 两种小鼠AMPKα2蛋白表达检测

TG鼠骨骼肌AMPKα2蛋白表达量始终高于WT鼠（P＜0.05）。

图1 AMPKα2蛋白表达图谱Figure 1. Representative Immunoblots of AMPKα2 Protein in Various Groups

2.2 4周有氧训练对小鼠骨骼肌ROS水平的影响

4周有氧训练后，WT和TG鼠骨骼肌ROS水平显著增加（P＜0.05）。与训练组WT鼠相比，训练组TG鼠骨骼肌ROS水平显著降低（P＜0.05，图2A）。

2.3 4周有氧训练对小鼠骨骼肌Nrf2-ARE结合活性的影响

4周有氧训练后，WT和TG鼠骨骼肌Nrf2-ARE结合活性显著增加（P＜0.05）；与训练组WT鼠相比，训练组TG鼠骨骼肌Nrf2-ARE结合活性显著增加（P＜0.05，图2B）。

2.4 4周有氧训练对小鼠骨骼肌抗氧化酶mRNA表达的影响

4周有氧训练后，WT鼠骨骼肌HO-1 mRNA和TG鼠骨骼肌（Gpx-1、NQO-1、HO-1、CAT） mRNA表达显著增加（P＜0.05，图3）。

2.5 4周有氧训练对小鼠骨骼肌抗氧化酶蛋白表达的影响

4周有氧训练后，WT鼠骨骼肌蛋白（CAT、SOD1、HO-1、GSR）表达显著增加（P＜0.05）；TG鼠骨骼肌蛋白（Gpx-1、CAT、SOD2、NQO-1，P＜0.05）和（GCLc、SOD1、HO-1、GSR，P＜0.01）表达显著增加；此外，与训练组WT鼠相比，训练组TG鼠骨骼肌蛋白（Gpx-1、SOD1、SOD2、HO-1、GSR、NQO-1，P＜0.05）和GCLc（P＜0.01）蛋白表达显著提高（图4）。

图2 骨骼肌ROS水平和Nrf2-ARE结合活性Figure 2. ROS Level and Nrf2 –ARE Binding Activity of Skeletal Muscle

3 讨论

3.1 4周有氧训练对Nrf2-ARE结合转录活性的影响

剧烈运动可以造成体内ROS产生增多［6］，使机体氧化还原系统失衡，过多的ROS可引起脂质过氧化，以及DNA、蛋白质的破坏，导致组织出现运动性损伤［17，21］。ROS是Nrf2活化的关键因子，可激活Nrf2转录活性增加［19］，进而提高机体抗氧化能力。1次持续6 h的急性剧烈运动即可提高小鼠骨骼肌Nrf2-ARE结合转录活性［1］。长期耐力训练也可使机体ROS生成增多，提高Nrf2及抗氧化酶的表达［4，12］。有文献报道，成年男性经过12周低强度耐力训练后，骨骼肌GSR和SOD蛋白表达显著增加［13］。大鼠游泳训练（1 h/天，5天/周，持续10周），可以使Nrf2蛋白表达增加［23］。年轻和老年小鼠10周耐力训练后，骨骼肌ROS水平增加，SOD、CAT蛋白表达提高［3］。Gounder的研究发现，经过6周适宜强度训练后，年轻和老年小鼠骨骼肌蛋白（Nrf2、GSR、HO-1、GPX-1）表达增加，但年轻鼠比老年鼠Nrf2转录活性显著增加［11，14］。本研究结果显示，4周有氧训练后，野生鼠骨骼肌ROS水平、Nrf2-ARE结合活性、HO-1 mRNA、蛋白（CAT、SOD1、HO-1、GSR）表达显著增加，提示，长期有氧耐力训练骨骼肌产生ROS，可诱导Nrf2-ARE结合活性的增强，进而提高抗氧化酶的表达水平。

图3 骨骼肌抗氧化酶mRNA表达Figure 3. Antioxidant Enzymes mRNA Expression of Skeletal Muscle

图4 骨骼肌抗氧化酶蛋白表达Figure 4. Antioxidant Enzymes Protein Expression of Skeletal Muscle

3.2 4周有氧训练诱导AMPKα2对Nrf2-ARE结合转录活性的影响

当细胞内AMP/ATP比值增加时，AMPK可被激活从而开始复杂的能量代谢调控［9］，近来的研究显示，氧化应激同样可以激活AMPK［6］。Wu的研究报道，在体外培养的血管内皮细胞中加入二甲双胍，激活AMPK的同时，观察到Nrf2及其下游抗氧化酶HO-1、NQO-1、GPx-1蛋白表达增加［21］。Mabfredi将具有抗肿瘤作用的β-内酰胺酶作用于大鼠神经胶质细胞，发现Nrf2及其下游抗氧化酶（HO-1、NQO1和CAT）蛋白表达增加；如果加入AMPK抑制剂，则这些酶的蛋白表达受到抑制［17］。Park等人研究发现，使用大黄素刺激神经胶质细胞后，Nrf2对HO-1和NQO1的转录活性增强，加入AMPK抑制剂后，这一作用受到阻滞［20］。Nrf2敲除鼠和野生鼠通过药物诱导成为肝癌小鼠，培养其肝细胞，而后分别给予两种鼠的肝细胞AMPK激动剂——AICAR孵育，表明野生肝癌鼠的肝细胞呈现Nrf2活化及有益的氧化还原反应改变，Nrf2敲除鼠的肝细胞没有这一变化［22］。以上研究表明，AMPK与Nrf2信号通路密切相关。

运动可造成机体氧化应激，同时伴有自身能量代谢的改变，因此运动对AMPK的激活作用可能更为复杂。目前，关于AMPK与运动氧化应激的关系并不十分清楚。有研究报道，肥胖大鼠经过8周跑台训练后，心肌组织AMPK活性提高，同时，ROS水平下降和SOD生成增加［15］。王大磊的研究发现，8周有氧运动训练可使大鼠海马组织AMPK蛋白表达增加，ROS、丙二醇（MDA）含量显著降低，SOD和 GPx-1 活性显著升高［2］。Brandauer研究报道，骨骼肌中含有失效的AMPKα2过表达亚基的小鼠和野生小鼠进行4周跑台运动训练，并伴随每日AICAR肌肉注射后，野生鼠比AMPKα2亚基过表达失效的小鼠骨骼肌MnSOD水平显著上升［5］。那么，长期有氧训练是否诱导AMPK参与Nrf2-ARE结合活性的调节？目前鲜见文献报道。

AMPK 是一种位于真核生物细胞中广泛存在的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，是一种异源三聚体蛋白，由 α、β、γ，3种亚基组成，每种亚基存在2或3种亚型 （αl、α2、β1、β2、γ1、γ2、γ3） ，其中，α亚基是AMPK的主要催化亚基，β和γ亚基主要起调节作用，并且在不同的哺乳动物组织中各种亚基的表达有所不同［18］。研究表明，AMPK的α2亚基与运动的相关性最大［6］，因此，本研究采用AMPKα2高表达转基因小鼠及其野生型小鼠为研究对象。本研究发现训练组AMPKα2转基因鼠与野生鼠相比，骨骼肌ROS水平显著降低，Nrf2-ARE结合活性显著增加，蛋白（Gpx-1、SOD1、SOD2、HO-1、GSR、NQO-1和GCLc）表达显著或非常显著增加。结果表明，AMPKα2在有氧训练运动造成的氧化应激中，对Nrf2-ARE结合活性可能起着重要的正向调节作用，进而有益于骨骼肌ROS的清除。然而，我们目前的实验结果仍无法确认AMPK是直接还是通过其他中间分子间接激活Nrf2，以及AMPK除了调节Nrf2外，是否还参与其他转录因子对抗氧化酶基因转录作用的调节，待于进一步深入研究。

4 结论

4周有氧训练可能诱导AMPKα2，促进Nrf2-ARE结合活性，进而增加抗氧化酶的蛋白表达，提高机体抗氧化能力。

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E ff ects of AMPKα2on Nrf2-ARE Binding Activity in Skeletal Muscle of Mice Induced by Aerobic Training for Four Weeks

LUO Lin1，2，HE Shi-yi1，YAN Lu1，JI Wei-xiu1，ZHANG Ying1

Objective：To investigate the e ff ects of AMPK alpha 2 on Nrf2-ARE binding activity in skeletal muscle of mice induced by aerobic training for four weeks and its possible mechanism.Methods：AMPK alpha 2 transgenic （TG） mice and its wild type （WT） were randomly divided into two groups，the control group and the training group，each group had 10 rats. The training group was carried on treadmill training with the slope of 0%，the speed of 12 m/min，1h/ days，6 days / week，for four weeks. Control group did not participate in training. 48 hours after the last training，the Nrf2-ARE binding activity of skeletal muscle，mRNA，protein expression and ROS content in skeletal muscle were measured. Results：After aerobic training for four weeks，1） ROS level and Nrf2-ARE binding activity in skeletal muscle of WT and TG mice increased signi fi cantly （P＜0.05）；compared with training group of WT mice，ROS level of TG rats in training group decreased significantly，Nrf2-ARE binding activity increased signi fi cantly （P＜0.05）. 2） mRNA HO-1 in training group of WT mice and （Gpx-1，NQO-1，HO-1，and CAT mRNA） in training group of TG mice were signi ficantly increased （P＜0.05）. 3） Protein （CAT，SOD1，HO-1，GSR，P＜0.05） expression in skeletal muscle of training group of WT rat，and protein （Gpx-1，CAT，and SOD2，NQO-1，P＜0.05，SOD1，GCLc；HO-1，GSR，P＜0.01） expression in skeletal muscle of training group of TG mice increased significantly；compared with WT rats，protein （Gpx-1，SOD1，SOD2，HO-1，GSR，NQO-1，P＜0.05；GCLc，P＜0.01） expression in skeletal muscle of TG rats in training group was signi fi cantly increased. Conclusion：Aerobic training of four weeks could induce AMPK alpha 2，promote the activity of Nrf2-ARE binding and improve the protein expression of antioxidant enzymes，which can improve antioxidant capacity.

AMPK alpha 2；Nrf2；aerobic training；skeletal muscle

G804.7

A

1002-9826（2017）06-0090-05

10. 16470/j. csst. 201706011

2016-12-30；

2017-08-19

国家自然科学基金项目（31471134）；中央高校基本科研业务费资助课题（2016BS026）；贵州省教育厅青年科技人才成长项目（黔教合KY字［2016］129）。

罗琳，女，副教授，在读博士研究生，主要研究方向为运动与骨骼肌代谢，E-mail：5925860@qq.com。

张缨，女，教授，博士，博士研究生导师，主要研究方向为运动与骨骼肌代谢，Tel：（010）62989584，E-mail：zhyi9256@126.com。

1北京体育大学 运动人体科学学院，北京100084；2贵州师范大学 体育学院，贵州 贵阳550001 1.Beijing Sport University，Beijing 100084，China；2.Guizhou Normal University，Guiyang 550001，China.