远隔缺血后适应对血管性认知功能损害小鼠模型白质的保护作用

王回 石晶 卞合涛 姬晓昙 王红娟 徐扬 闫中瑞

目前痴呆症患病率越来越高，已经严重威胁人类的健康，其认知功能下降的病因中血管病变占重要因素，血管性认知功能损害(vascular cognitive impairment，VCI)包括临床上有轻度认知功能障碍者及血管性痴呆[1,2]。其早期特征脑血流量的减少导致低灌注，病理特征之一是白质慢性缺血损害，并且由小血管功能障碍、炎症、胶质细胞激活、血脑屏障破坏等多因素参与病理过程，并最终导致白质脱髓鞘[1,2]。临床症状表现认知障碍、步态异常、精神异常及残疾程度等与病变严重程度密切相关[1-4]。因此早期干预VCI非常重要及迫切的。

其中远隔缺血后适应(remote ischemic postconditioning，RIPostC)是一种经济简便的治疗缺血性脑血管疾病的方法，即机体重要器官(如心脑等)缺血事件发生后给四肢等耐缺血器官一个短暂的非致死性的轻度缺血处理，启动一系列内源性保护机制，从而减弱远隔器官致死性缺血损伤[5,6]。Khan等[6]研究RIPostC治疗VCI小鼠模型可以改善认知功能，可能通过抑制脑内炎症反应，阻止神经元死亡、减少β淀粉样蛋白(amyloid β protein，Aβ)产生及积累等保护脑白质的机制，RIPostC在脑缺血等疾病治疗已经取得了不错的效果，显示出广阔的临床应用前景。本实验通过小鼠双侧颈总动脉狭窄(bilateral common carotid artery stenosis，BCAS)建立脑白质损伤动物模型，BCAS可以适度降低脑血流量，模拟慢性脑组织血流量减少引起低灌注所致的白质损伤，研究RIPostC对VCI小鼠认知功能的影响，初步探讨RIPostC通过自噬途径对脑白质保护作用的机制。

材料和方法

一、实验材料

1.实验动物和分组：清洁级健康雄性C57BL/6J小鼠，12只，体质量24～28 g，购自辽宁长生生物技术有限公司 许可证号：SCXK(辽)2015-0001。12 h昼夜交替光照条件下饲养，适应性饲养一周后进行实验。小鼠随机分为假手术组(sham组)、模型对照组(BCAS组)及模型-远隔缺血组(BSAS+RIPostC)，每组保证存活4只小鼠。术前8～10 h禁食，术后予以充足的食水。

2.主要仪器和试剂：超纯水系统(香港Heal Force公司)、Microcoil环(无锡萨密你弹簧有限公司)、Morris水迷宫(安徽正华生物仪器设备有限公司)、石蜡切片机(Leica 德国)、显微镜(OLUMPUS 日本)、电泳仪(北京六一)，内参抗体β-actin、全蛋白提取试剂盒、Beclin-1 antibody(wanleibio 中国)。

二、方法

1.BCAS小鼠模型的建立：参考文献[7]，10%水合氯醛麻醉(3.5 ml/kg)麻醉小鼠后固定于手术台上，备皮、消毒后于颈正中切口，钝性分离两侧组织，于动脉鞘内分离出颈总动脉，长约2 cm，首先将左侧颈总动脉用显微镊架起，在动脉分叉处下方将microcoil环旋转、套扎在动脉上，1 min左右，30 min后以同样方法狭窄右侧血管。术中注意避免伤及迷走神经及观察小鼠呼吸状况。狭窄后整理组织、缝合、并消毒，将小鼠放回笼中，待其自然苏醒并恢复自由饮食取水。手术期间维持肛温在37℃左右。sham组小鼠仅切开颈中线皮肤并暴露双侧颈总动脉，不进行狭窄操作。

2.模型验证：手术2 h后，将小鼠麻醉，固定于小鼠立体定位仪上，选择前卤后1 mm，旁开2.5 mm处为监测位置。用牙科钻在监测点打磨并穿破颅骨，将激光多普勒的探头尖端对准监测点，调整探头位置，保证基线血流维持大于800 PU。操作中避免伤及脑组织。激光多普勒仪显示深部白质区血流在双侧颈总动脉狭窄后降低60%～80%，小鼠苏醒后无明显行为学异常代表模型建立成功。

3.RIPostC的处理方法：手术后14～28 d，BCAS+RIPostC组小鼠双侧后肢同时进行RIPostC处理。小鼠麻醉后，使用线绳捆绑小鼠双侧后肢根部，拉紧线绳阻断血流，持续5 min，阻断股动脉标志是脉搏消失、肢体远端温度下降、皮肤发紫为标准；松开线绳，以脉搏波重新出现、肢体远端温度回升、皮肤潮红为再灌注标志，持续5 min，如此反复4次/d，持续处理2周。

4.水迷宫实验评估小鼠认知能力：各组小鼠在手术4周后进行Morris水迷宫实验进行认知能力检测。本实验采用经典Morris水迷宫测试程序。水温保持在(22±2)℃。定位航行试验：实验前将小鼠置于站台上适应20 s，随后将其从第1象限面壁置入池内，小鼠再登上站台5 s后终止记录。最长记录时间为60 s，若小鼠在60 s内不能上台，则引导其登上站台适应10 s，最后擦干小鼠放入鼠笼。按此方法从第1象限开始而后按第2、3、4象限顺序进行试验，每天4个象限，共测试4 d。记录每天4个象限的平均上台潜伏期。空间探索试验：实验的第5 d，撤除水面下的站台，然后将小鼠从第1象限面壁置入池内，记录小鼠在60 s内的游泳轨迹并分析，不测试剩余的象限。记录小鼠穿越平台次数及在第3象限的时间(靶象限)占总时间的百分比，以评判小鼠的空间记忆能力。

5.HE染色检测各组小鼠大脑白质病理损伤情况：水迷宫实验后脱颈处死小鼠，然后剥离颅骨，迅速切取脑部白质组织用于后续实验检测，经包埋切片、脱蜡至水、染色等步骤后，于显微镜下观察染色效果，200×镜下拍照。

6.Western blot检测：Western blot检测各组小鼠大脑白质组织中自噬相关蛋白Beclin-1水平的表达。根据每个样本的质量及体积加入相应体积的裂解样本，冰上静置5 min，4℃低温下冷冻离心机，12 000 r/min，离心10 min，分离上清蛋白质抽提物。之后蛋白质定量，待测样本蛋白抽提物分别用1 μL与19 μL PBS缓冲液混匀，BCA法，读取数据，计算样本的蛋白浓度，进行SDS-PAGE电泳，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，TBST洗三遍，一抗4℃过夜，TBST洗3遍，二抗室温孵育1 h，TBST洗三遍后化学发光显色，化学发光成像仪自动曝光成像显影，测定各条带灰度值等步骤，用凝胶图象处理系统(Gel-Pro-Analyzer软件)分析。

三、统计学处理

结 果

一、Morris水迷宫实验结果

定位航行实验中各组小鼠逃避潜伏期时间随着训练天数增加逐渐缩短。与sham组比， BCAS组及BSAS+RIPostC组小鼠平均逃避潜伏期延长(P>0.05)， BSAS+RIPostC组成绩优于BCAS组，但两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。第5天空间探索实验中，与sham组比， BCAS组及BSAS+RIPostC组穿越平台次数减少，BSAS+RIPostC组成绩优于BCAS组，但两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。在第3象限的时间(靶象限)占总时间的百分比，sham组(33.8%)，BCAS组(17.34%)，BSAS+RIPostC组(20.56%)，BCAS组及BSAS+RIPostC组两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。游泳轨迹中，与sham组相比，BCAS组小鼠呈现杂乱无章的平台搜索轨迹，BSAS+RIPostC组比BCAS组呈现一定的规律性(图1～3)。

二、HE 染色结果

各组形态变化比较如图4。 sham组小鼠脑白质组织神经细胞分布均匀，形态完好，细胞核染色清晰，无明显的病理改变。BCAS组白质中可见神经细胞有较明显的形态改变，细胞皱缩，细胞核固缩，深染。但未见明显的细胞破碎与减少。与BCAS组相比，而BCAS+RIPcostC组细胞病理改变有所减轻。

三、Western blot检测结果

根据实验结果可以看出，相比于sham组， BCAS组及BCAS+RIPcostC组小鼠白质组织中Beclin-1水平的表达上调(P<0.05)，相比于BCAS组，BCAS+RIPcostC组Beclin-1蛋白水平的表达上调(P<0.05，图5)。

讨 论

VCI主要的病理特点为脑室周围、半卵圆中心的白质脱髓鞘病变[1,2]。Bink等[8]研究认为BCAS小鼠模型是模拟VCI最好的和最有效的动物模型，该模型可适度降低脑血流量模拟慢性脑组织低灌注疾病，再现了脑缺血、神经炎症反应、血脑屏障破坏、白质损伤等一系列引起认知损害等的病理过程，也避免了颈动脉结扎模型对视觉通路的损害等的并发症。RIPostC对脑缺血等脑部疾病治疗已经取得了不错的成绩,认为RIPcostC具有脑保护作用[6,9]。 Morris水迷宫是研究动物以视觉为基础的空间学习记忆能力的常用经典行为实验方法，能比较准确的反映实验动物的空间学习、记忆、空间定向、定位等认知能力的变化。定位航行实验中潜伏期越短、空间探索实验中穿过平台次数越多证明小鼠学习、记忆能力越强。本实验sham组小鼠定位航行及空间探索能力高于BCAS组及BCAS+RIPcostC组，说明BCAS已经损害sham组及BCAS+RIPcostC组认知功能。从均值分析能够大概看出各组小鼠学习、记忆能力变化趋势，BCAS+RIPcostC组空间学习、记忆能力较BCAS组有所提高，提示RIPostC对BCAS导致的小鼠认知损伤有改善作用，但是BCAS及BCAS+RIPcostC组之间平均逃避潜伏期及穿过平台次数无显著性差异，这一结果可能与动物间个体化差异及实验样本数偏少有关。HE染色示sham组小鼠脑白质无明显的病理改变，BCAS组可见神经细胞有较明显的形态改变，而BCAS+RIPcostC组较BCAS组相比，细胞病理改变有所减轻，提示RIPcostC对慢性缺血所致的脑白质病变有保护作用，这与Khan等[6]研究结果一致，并且RIPcostC能提高小鼠学习能力及增加小鼠脑血流量，停止RIPostC处理2周后，发现仍有持久增加小鼠脑血流量的作用。Meng等[8]报道使用简单的血压计袖口实施上肢RIPostC，持续治疗300天，发现能增加颅内动脉狭窄患者脑血流量和预防脑卒中复发，此方法简单方便易操作在临床上有长期治疗的可行性。Khan采取动物造模成功后即开始每天1次的RIPcostC治疗[6]，本实验在造模成功2周后实施每日4次持续2周的治疗，而Meng对患者进行长达300天的治疗[9]，均取得一定程度治疗效果，因此，为取得最佳治疗效果，RIPcostC治疗VCI等脑部慢性缺血疾病的合适时间窗及疗程需进一步探索。

自噬是粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜形成自噬体，可与溶酶体融合形成自噬溶酶体(自噬小体)，通过降解、回收自身细胞碎片及清除受损线粒体等，维持细胞内营养平衡稳态，以抵御营养匮乏、环境压力、感染、衰老等，使细胞损伤减到最小，延长生存时间的一种细胞生存机制，然而，过度或失控的自噬可以导致细胞死亡，通常被称为自噬性细胞死亡，目前自噬成为研究热点[10,11]。Beclin-1是哺乳动物中发现最早的一个自噬基因，主要通过与Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶形成复合体来控制自噬体的形成从而产生自噬，是调控自噬的正向关键因子，上调Beclin-1表达能够促进自噬活性的增高，一般情况下Beclin-1与抗凋亡蛋白bcl-2结合抑制自噬小体形成，而细胞在饥饿的情况下，Beclin-1与bcl-2解离，并与Vps34和UVRAG等形成复合体诱导自噬小体形成[10-12]。近期Swaminathan等[13]研究表明Beclin-1参与β淀粉样蛋白前体蛋白(Amyloid β precursor protein，APP)降解途径，认为自噬影响神经细胞内β淀粉样蛋白代谢。此外，Khan等[6]采用酶联免疫吸附法检测到VCI小鼠动物模型的BCAS组中Aβ在皮层及海马神经元的胞体周围大量产生和沉积，与BCAS组相比，在BCAS + RIPostC组经过2周RIPostC治疗后Aβ含量明显降低。而APP水解可以产生具有神经毒性的Aβ，由于Aβ斑块沉积是痴呆症及阿尔茨海默病等的病理特点，提示我们通过RIPostC治疗上调Beclin-1可作为是一种调控靶点，适当激活自噬以清除Aβ，避免Aβ的神经毒性损害，上调抗凋亡蛋白bcl-2以抑制神经元凋亡。本实验中，与sham组相比，BCAS 组Beclin-1表达上调，说明BCAS处理后能够激活小鼠脑白质组织中的细胞自噬，在RIPostC处理后，小鼠脑白质中细胞自噬水平进一步提高，提示RIPostC处理有逆转脑白质病理改变、清除Aβ、增加脑血流量等作用，推测其脑白质保护作用可能通过进一步提高自噬水平所达到。

本实验研究存在一定的局限性，BCAS小鼠实验样本量偏少，RIPostC治疗时间偏短，后续实验将增加样本量及延长观察治疗时间。总之，目前研究RIPostC对脑白质的保护作用可能是通过将自噬调整在合适水平来发挥的，具体机制仍然不十分清楚，还需进一步的研究，为研究新的药物靶点及临床治疗提供理论基础，推广经济简便的RIPcostC治疗方法对临床应用具有重要意义。