ELISA法诊断类风湿关节炎的虚拟仿真实验设计方案

王丽娜　鞠吉雨(通讯作者)　彭美玉　付晓燕　徐灵芝

【中图分类号】R7 【文献标识码】A 【文章编号】2095-6851（2017）11--02

1 临床案例：

某患，女，23岁，主述“晨僵3月余，伴腕掌关节痛2月余”。患者3个月前无明显诱因出现晨僵，每次持续时间在2小时左右，后自行缓解。2个月前出现腕、掌指关节痛。

查体：腕关节，近端指关节压痛，双侧指关节对称性关节肿，右手掌指关节处见皮下结节，余无特殊。

免疫学检查：IgG15.3g/L、IgA4470mg/L、IgM3640mg/L、C30.98g/L、C40.24g/L、RF360IU/ml、ANA（-）、Anti-dsDNA（-）、ENA（-）、AKA（+）、CCP（+）CRP116mg/L、AAG829mg/L。

2 ELISA简介：

酶聯免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），其基本原理是：利用标记技术将酶标记到抗体或抗原上，然后将其与待检物中相应的抗原或抗体与酶标记抗体或抗原发生特异性反应。在遇到相应的酶底物时，酶能高效、专一催化底物，生成带颜色的产物。借助反应体系的颜色变化及呈色深浅，待检物中有无特异的抗原或抗体及其含量。

该方法可对待检样品进行定性和定量分析；同时具有微量、高效、特异、经济、方便的特点，因此是一种广泛应用于生物和医学领域的微量检测技术。应用ELISA技术进行测定的方法很多，根据检测目的和操作步骤的不同，通常有三种类型的检测方法。

（1）间接法：主要用于检测抗体。此法是检测抗体最常用的方法。将已知抗原吸附于固相载体上，加入待测血清（抗体）与之结合，洗涤后，加酶标抗体和底物进行测定。

（2）双抗体夹心法：此法常用于检测抗原。将已知抗体吸附于固相载体，加入待测标本（含相应抗原）与之结合，温育后洗涤，加入酶标抗体及底物溶液进行测定。

（3）抗原竞争法：此法主要用于抗原及半抗原的定量测定。小分子抗原或半抗原因如小分子激素、药物等，由于缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。以测定抗原为例，将待检标本中（即待检抗原）和一定量的抗体结合，随后将抗原抗体反应的混合物加入已包被抗原的固相载体上，洗涤后加入酶标记的第二抗体进行后续反应，原理与间接ELISA相似。由于只有游离的抗体能够和已知的抗原结合，因此标本中的抗原含量愈多，结合在固相上的抗体愈少，最后的显色也愈浅，反之，结合于固相的抗体越多，说明待检样本中的抗原越少，显色就越深，即最后的显色反应与待测抗原含量呈负相关。

3 实验目的

通过案例，引出ELISA在疾病免疫学诊断中的应用；通过虚拟实验操作让学生熟悉ELISA的原理，操作步骤，常用试剂及实验设备，实验注意事项等，以及ELISA实验中用到的相关抗体的特点及抗原抗体结合等知识点。拓宽学生的知识面，引导学生理论联系实际，理论联系临床。

4 实验设计：

4.1 通过类风湿关节炎的案例，引入ELISA在该病免疫学诊断中的应用。引导学生查阅有关ELISA相关资料，如ELISA的原理，方法和用途等，学生也可以点击预习按钮预习我们提供的有关ELISA的理论，为后续的实验打好基础。

4.2 通过问题的提出，引导学生进行虚拟实验操作，问题如下：

4.2.1 免疫学检查类风湿因子RF含量常用什么方法，如何操作？

有间接法和双抗体夹心法两种方法可选，让学生先选择方法，选择正确后可以点击继续按钮，继续后续实验步骤的操作。

双抗体夹心ELISA法检侧IgGRF实验步骤：.

①包被：每孔100ul兔IgG（100ng/ml，包被液为碳酸盐缓冲液pH9.6），4℃过夜，室温封闭1h（封闭液PBS+0.5%Tween20+10%小牛血清）。

②每孔100ul1：100稀释待测血清，37℃温箱孵育2h。

③每孔加100ul兔抗人IgG-HRP（1：1000稀释），37℃温箱孵育2h

④ABTS（稀释液为柠檬酸）15min显色，410nm波长读OD。

每一步均用PBS+0.5%Tween20洗涤三遍，每板有阳性对照和阴性对照。

3.2.2 免疫学检测抗环瓜氨酸肽抗体（CCP）常用什么方法，如何操作？

有间接法和双抗体夹心法两种方法可选，让学生先选择方法，选择正确后可以点击继续按钮，继续后续实验步骤的操作。

间接ELISA检测抗环瓜氨酸肽抗体的实验步骤：

①用纯化的抗原包被微孔板，制成固相抗原。

②往包被抗原的微孔中加入100ul待测血清，37℃温箱孵育45分钟。

③每孔加入100ulHRP标记的抗人IgG抗体，37℃温箱孵育30分钟。形成抗原-抗体-酶标抗体复合物。

④加100ul底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的抗环瓜氨酸肽抗体（Anti-CCP）呈正相关。

⑤用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人抗环瓜氨酸肽抗体（Anti-CCP）浓度。

每一步均用PBS+0.5%Tween20洗涤三遍，每板有阳性对照和阴性对照。3.2.3在检测抗环瓜氨酸肽抗体（CCP）的实验中，酶标二抗有多种选择，比如用酶标羊抗鼠IgG抗体，酶标羊抗人IgG抗体，酶标羊抗兔IgG抗体，酶标羊抗马IgG抗体，要选择哪一种，为什么？

注：实验步骤中加下划线的部分是学生需要选择的正确答案，需要把相应的正确答案点选到相应的步骤中实验才能继续进行，才能得分，选错不得分。

5 虚拟实验操作

5.1 虚拟实验所需器材及试剂：类风湿因子ELISA检测试剂盒，抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒。洗涤液（PBS）、酶底物、终止液，滤纸，温箱，废液缸，加样器，湿盒，酶标板，酶标仪

5.2 虚拟实验场景：实验室操作台

5.3 虚拟实验结果：阳性孔加底物后显色，阴性对照孔不显色。

5.4 虚拟实验注意事项：洗涤要彻底，底物要先用现配，避光显色。

5.5 虚拟实验计分系统：每个选项选错不得分，选对一个得一分。

5.6 虚拟实验相关知识：抗原抗体反应的原理和特点；抗体的特性；ELISA的基本原理，方法，结果判断和用途。

参考文献

邵晓凤，栗占国.类风湿关节炎免疫学诊断方法及其临床意义，中华检验医学杂志，2007，30（5）：592-594

赵文秀，李妍，类风湿性关节炎的免疫学诊断研究进展，解放军医学高等专科学校学报，1999（2）：152-154

王玉辉，几种免疫学指标联合检测在类风湿性关节炎诊断中的价值，中国民康医.学，2010，22（14）：1769-1769

史立，甘晓月，董怡.ELISA法检测三种类型的类风湿因子，张家口医学院学报，1994，11（3）：14-16.endprint