RBM8A在人结肠癌细胞株中的表达及其意义

徐益彩 梁嵘 林燕 刘志辉 李永强

RBM8A在人结肠癌细胞株中的表达及其意义

徐益彩 梁嵘 林燕 刘志辉 李永强

作者单位：530021 南宁 广西医科大学附属肿瘤医院消化肿瘤内科

目的检测RBM8A在不同结肠癌细胞株中的表达，为进一步体外实验筛选靶细胞。方法采用实时定量反转录聚合酶连锁反应（qRT-PCR）法以及蛋白免疫印迹（Western-blot）法检测RBM8A在结肠癌细胞株SW480、SW620、HT29、LOVO、COLO320DM、T84及人正常结肠上皮细胞株NCM460中的表达。结果RBM8A在7株细胞株中均有表达，其中在结肠癌细胞株SW620和COLO320DM中的表达高于正常细胞株，差异有统计学意义（P＜0.05），而其余细胞株中RBM8A的表达与正常细胞株差异无统计学意义（P＞0.05）。结论RBM8A在结肠癌细胞株SW620和COLO320DM中高表达，SW620和COLO320DM细胞株或可作为靶细胞。

结肠肿瘤；结肠癌细胞系；RBM8A；实时定量反转录聚合酶连锁反应；蛋白免疫印迹

结肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，发病率在男性中排名第三，女性排第二［1］。结肠癌在亚洲地区的发病率呈上升趋势，一些国家推出结肠癌早期筛查项目，明显降低了结肠癌的死亡率［2］。因此，研究结肠癌发病过程，寻找稳定的肿瘤标志物对结肠癌的早期诊断和治疗至关重要。

肿瘤发生的原因之一是基因突变及错误翻译。无意义密码子介导mRNA降解（nonsense-mediated mRNA decay，NMD）是真核细胞重要的RNA监视机制，可识别并降解异常的mRNA，以避免异常蛋白对细胞造成损伤［3］。核糖核酸结合基序蛋白RBM8A是NMD的核心成员之一，RBM8A的表达量可反映NMD的活跃程度。已有研究发现RBM8A在肝细胞癌、肺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤中异常表达［4-6］。同时，RBM8A也是RNA结合基序蛋白（RBM）家族的一员，参与调控基因表达、细胞周期和细胞凋亡过程［7］，提示RBM8A异常表达可能是恶性肿瘤转化的重要机制之一。目前RBM8A蛋白在结肠癌中的表达及其意义尚不清楚，本研究检测RBM8A在不同结肠癌细胞株中的表达，以筛选阳性靶细胞进行下一步实验研究。

1 材料和方法

1.1细胞系

结肠癌细胞株 HT29、LOVO、COLO320DM、T84 购自上海歌凡生物技术公司，结肠癌细胞株SW480和SW620由广西医科大学肿瘤实验研究部提供，正常人结肠上皮细胞株NCM460由福建医科大学肿瘤干细胞研究院惠赠。

1.2主要试剂

RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、荧光定量试剂盒均购自大连宝生物（TAKARA）公司。RBM8A小鼠单克隆抗体、HRP标记马抗小鼠多克隆抗体均购自Abcam公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 HT29细胞置于McCOY'5A培养基，LOVO细胞置于F12K培养基，T84细胞置于D-MEM/F-12 培 养 基 ，COLO320DM、SW620、SW480、NCM460细胞置于RPMI 1640培养基，所有细胞均补充10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和链霉素，在37℃、5%CO2培养箱中培养，取对数生长期细胞进行实验。

1.3.2 qRT-PCR检测RBM8A mRNA在结肠癌细胞中的表达 根据GeneBank数据库中RBM8A序列设计引物，上游引物：5'-AGATGGCGGACGTGCTAGA-3'，下游引物：5'-CTCCACGCTGTCATAATCCTCA-3'，引物由深圳华大基因合成。按试剂盒说明书提取细胞总RNA，聚丙乙烯凝胶电泳检测RNA完整性后逆转录成cDNA，并进行PCR扩增，反应条件：95℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40个循环；以β-actin为内参，各细胞系间RBM8A基因的相对表达量通过2-△△Ct法确定，对照组为正常肠上皮细胞株NCM460。相对表达量≥2认为差异有统计学意义。每个样本均设3个复孔，实验重复3次。

1.3.3 Western blot检测RBM8A蛋白在结肠癌细胞中的表达 提取对数生长期细胞总蛋白，BCA法进行蛋白定量，每孔上样20 μg蛋白，同时加4 μL蛋白预染Marker作为标准参照进行电泳、转膜，转膜结束后取出PVDF膜，观察Marker的转移效果，确定转移后进行脱脂牛奶封闭、孵一抗和二抗，采用ECL化学发光法进行检测。

1.4 统计学方法

采用IBM SPSS Statistics 19.0软件进行数据分析，计量数据采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验。以Plt;0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RBM8A mRNA在正常人结肠上皮细胞和结肠癌细胞中的表达

qRT-PCR结果显示，以正常人结肠上皮细胞株NCM460为对照，RBM8A mRNA在结肠癌细胞株中的相对表达量分别为COLO320DM：8.75±0.30；SW620：3.78±0.23；LOVO：1.47±0.61；SW480：1.43±0.16；HT29：1.38±0.12；T84：1.11±0.03。RBM8A mRNA 在结肠癌细胞株SW620和COLO320DM中的表达高于正常细胞株，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 RBM8A mRNA在正常人结肠上皮细胞和结肠癌细胞中的表达

2.2 RBM8A蛋白在正常人结肠上皮细胞和结肠癌细胞中的表达

Western blot 结果显示，SW480、SW620、HT29、LOVO、COLO320DM、T84和 NCM460等 7株细胞均在大小约为21kD处出现一特异性条带（图2），说明RBM8A蛋白在7株细胞中均有表达。灰度值统计显示RBM8A蛋白在SW620和COLO320DM细胞株中高表达，差异有统计学意义（P＜0.05），其余细胞株与正常细胞株差异无统计学意义（P＞0.05）。

图2 RBM8A蛋白在正常人结肠上皮细胞和结肠癌细胞中的表达

3 讨论

结肠癌是常见的恶性肿瘤之一，发病率在世界不同地区差异较大。据统计，目前结肠癌的发病率和死亡率在发达国家呈下降趋势［8］。但青年人群结肠癌［9］的发病率却逐年上升。从病因看，结肠癌半数以上来自腺瘤癌变。因此研究结肠癌的癌变过程，寻找新的诊断和治疗靶点对早期诊断和改善预后尤为重要。

RBM8A是RNA结合基序蛋白家族中的一员，参与形成外显子连接复合体，也是NMD的核心蛋白之一。NMD是真核mRNA的监视机制，可迅速清除异常mRNA，阻止异常蛋白的产生［7］。作为NMD的关键因子，RBM8A表达量可反映NMD的活跃程度，提示是否存在异常的蛋白表达。研究发现，RBM8A在肝细胞癌、肺癌、子宫颈癌、乳腺癌以及多发性骨髓瘤中异常表达。Kim等［10］发现伴淋巴结转移的子宫颈癌中，RBM8A表达明显增高；Carrasco等［11］发现多发性骨髓瘤中存在RBM8A异常表达。Liang等［4］发现肝细胞癌组织中存在RBM8A高表达，其表达水平与肿瘤直径、HBsAg、TNM分期、Edmondson病理分级呈正相关，且发现存在RBM8A高表达的肝细胞癌细胞系的增殖、侵袭能力增强，凋亡能力减弱，提示RBM8A可能与肝细胞癌的发生以及转移有关。冉亮等［12］发现RBM8A在乳腺癌组织中的表达明显高于正常组织，且在组织学Ⅲ级和有腋窝淋巴结转移的乳腺癌组织中表达更高，提示RBM8A可能参与乳腺癌的形成及转移。Ishigaki等［13］发现沉默RBM8A后，非小细胞肺癌细胞株A549的克隆形成能力下降，细胞周期出现G2/M期阻滞，不能进行正常有丝分裂，提示RBM8A可能与肺癌细胞株的增殖凋亡有关。以上研究结果均提示RBM8A在肿瘤的形成、进展以及肿瘤细胞的生长周期中可能发挥重要作用，可能是肿瘤诊断与基因治疗的潜在靶点。

目前，关于RBM8A在结肠癌中的表达及其作用的研究甚少，本研究初步筛选了存在RBM8A高表达的细胞系，通过qRT-PCR和Western-blot实验验证了RBM8A在结肠癌细胞株中均有表达，其中在SW620和COLO320DM细胞中存在高表达。SW620是结肠癌淋巴结转移细胞系，可进一步研究其增殖、侵袭能力等，同时探究RBM8A在结肠癌转移中的作用，以进一步证实RBM8A作为结肠癌诊断标志物和基因治疗的潜在靶点。

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RBM8A expression and its role in human colon carcinoma cell lines

Xu Yicai，Liang Rong，Lin Yan，Liu Zhihui，Li Yongqiang（Department of Gastroenterology Oncology，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）

ObjectiveTo detect RBM8A expression in human colon carcinoma cell lines in order to select the most appropriate cell line for further study.MethodsRBM8A expression was examined in the following cell lines using quantitative RT-PCR and Westernblotting：SW480，SW620，HT29，LOVO，COLO320DM，T84，and NCM460 enterocytes.ResultsRBM8A mRNA and protein were detected in all seven cell lines.RBM8A expression was higher in SW620 and COLO320DM cell lines than in normal enterocytes（P＜0.05）.Expression was similar between the normal enterocyte cell line and other cell lines（P＞0.05）.ConclusionRBM8A expression is higher in SW620 and COLO320DM cell lines，so they may be more suitable for more extensive laboratory studies.

Li Yongqiang.E-mail：lyq702702@126.com

Colorectal neoplasms；Colon carcinoma cell lines；RBM8A；RT-PCR；Western blotting

R735.3

A

1674-5671（2017）05-04

10.3969/j.issn.1674-5671.2017.05.07

广西自然科学基金资助项目（2016GXNSFBA380090）；广西科学研究与技术开发计划资助项目（桂科AB16380215）；广西医疗卫生适宜技术开发与推广应用资助项目（S2017101，S201634）

李永强。E-mail：lyq702702@126.com

梁嵘为并列第一作者

［2017-07-05收稿］［2017-08-12修回］［编辑 罗惠予］