FPN1、DMT1在肝细胞癌中的表达及其与药物疗效的关系

秦稚钧 黄露 曾小懿 杨伟萍 廖小莉 李永强 韦长元 刘志辉

FPN1、DMT1在肝细胞癌中的表达及其与药物疗效的关系

秦稚钧1，2黄露1，2曾小懿1，2杨伟萍1廖小莉1李永强1韦长元1刘志辉1

作者单位：530021 南宁1广西医科大学附属肿瘤医院；2广西医科大学研究生院

目的研究膜铁转运蛋白1（ferroportin 1，FPN1）和二价金属离子转运体1（divalent metal transporter 1，DMT1）在人肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）癌组织中的表达及与临床病理特征、药物疗效的关系。方法回顾性收集行肝癌切除术后复发转移并接受化疗或索拉非尼治疗的HCC患者的临床及病理资料。采用免疫组化法检测HCC癌组织中FPN1及DMT1的表达，分析其与HCC患者临床病理特征、药物疗效的关系。结果27例HCC患者无完全缓解者，其中接受奥沙利铂联合替吉奥方案化疗16例，获部分缓解2例，疾病稳定2例，疾病控制率（DCR）为25.0%；接受索拉非尼治疗1 1例，部分缓解1例，疾病稳定2例，疾病控制率为27.3%。全组患者中位PFS为5.4个月，中位OS为10.0个月。FPN1和DMT1在HCC癌组织中的阳性表达率分别为62.96%和81.48%，FPN1及DMT1的表达与肿瘤分化程度相关（P＜0.05），与其他临床病理特征无关（P＞0.05）。FPN1阳性患者的DCR为41.2%，中位PFS为6.7个月，中位OS为15.7个月，优于阴性患者的10.0%、1.8个月和8个月（P＜0.05）；DMT1阳性患者的DCR为18.2%，中位PFS为3.2个月，中位OS为9.3个月，低于阴性患者的60.0%、18.6个月和35.9个月（P＜0.05）。结论FPN1和DMT1在HCC中的表达可能受癌细胞分化程度影响，与晚期HCC患者药物治疗后的远期生存有关。

肝肿瘤；膜铁转运蛋白1；二价金属离子转运蛋白1；化疗；靶向药物治疗；索拉非尼

原发性肝癌（primary liver cancer，PLC）中 90%为肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）。我国每年有超过30万人死于PLC［1-2］，主要原因是大部分患者就诊时已属中晚期，缺乏有效的治疗手段。系统化疗（即全身化疗）及分子靶向药物在延长生存时间及改善生活质量方面尽管明显优于最佳支持治疗，但实际效果并不理想。癌细胞的耐药性是晚期HCC患者化疗或靶向药物治疗效果不佳的主要原因。耐药机制主要包括肿瘤乏氧环境、DNA修复酶过表达、突变型P53蛋白高表达引起癌细胞凋亡受抑制、癌细胞膜高表达P-糖蛋白及多药耐药相关蛋白1（multidrug resistance associated protein-1，Mrp-1）引起阿霉素外流等，对这些耐药机制进行逆转的研究目前进展不大［3］。研究发现肝癌细胞内微量元素锰的含量影响了癌细胞对阿霉素的敏感性［4］，这为逆转肝癌化疗耐药提供了新的思路和方法。

微量元素锰（Mn）是锰超氧化物歧化酶（manganese superoxidedismutase，MnSOD）活性中心的关键组成部分，MnSOD可调控细胞内活性氧族（reactive oxygen species，ROS）的产生，而ROS则影响化疗药物及索拉非尼的抗癌效果［5-6］。膜铁转运蛋白 1（ferroportin 1，FPN1）能将锰从细胞内转运至细胞外［7］。二价金属离子转运体 1（divalent metal transporter 1，DMT1）是动物肠道中发现的唯一二价锰转运载体，能将Mn2+转运至细胞内［8］。因此推测FPN1和DMT1的表达可能影响细胞内锰元素含量而最终影响抗癌药物对肝癌细胞的效果。本研究检测了HCC癌组织中FPN1和DMT1的表达，并分析其与临床病理特征及药物疗效的关系，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 病例选择

收集2010年1月至2015年12月在广西医科大学附属肿瘤医院行肝癌切除术后出现肿瘤复发或转移，且不宜再次行手术或其他局部治疗，并接受全身化疗或索拉非尼治疗的HCC患者的临床资料以及手术切除的癌组织标本。共有27例患者符合标准纳入研究，中位年龄为44岁；肝功能分级均为Child-Pugh A级，东部肿瘤协作组（eastern cooperative oncology group，ECOG）行为能力（performance status，PS）评分在0~1分。对所有患者进行随访，随访时间截至2017年2月28日。患者的基本资料见表1。

表1 27例HCC患者术前的临床病理特征

1.2 药物治疗方法

27例患者中接受化疗16例，方案为奥沙利铂+替吉奥（奥沙利铂130 mg/m2，d1；替吉奥胶囊40 mg，bid，d1~14，21 d为一个周期）；接受索拉非尼治疗（400 mg，bid）11例。上述治疗均持续至肿瘤进展或出现不可耐受的不良反应。

1.3 疗效评价

根据RESIST 1.1标准［9］进行客观疗效评价，分为完全缓解（CR）、部分缓解（PR）、疾病稳定（SD）和疾病进展（PD）。无进展生存期（progression-free survival，PFS）指患者接受化疗或靶向治疗开始至第一次发生疾病进展且存活的时间。总生存期（overall survival，OS）指患者接受化疗或靶向治疗开始至因任何原因引起死亡的时间。疾病控制率（disease control rate，DCR）指经治疗后评价为缓解（CR、PR）和稳定（SD）的病例数占可评价例数的百分比。

1.4 FPN1、DMT1的检测及判定标准

FPN1购自Abcam公司，DMT1购自Novus公司。采用免疫组织化学法检测HCC癌组织中FPN1、DMT1的表达。FPN1、DMT1表达的判断参考相关文献［10-11］，标准如下：⑴根据阳性细胞染色强度计分：细胞未着色，记0分；细胞染成浅黄色为弱阳性，记1分；细胞染成棕黄色且无背景着色，或细胞染成棕褐色并有浅棕色背景为中等阳性，记2分；细胞染成棕褐色且无背景色，记3分。⑵根据阳性细胞所占百分比计分：无阳性表达细胞，记0分；1%≤阳性表达细胞数≤25%，记1分；25%＜阳性表达细胞数≤50%，记2分；阳性细胞数＞50%，记3分。将每片切片随机5个视野以上两项分数乘积的平均值判断其染色结果：0～2分为阴性，3分及以上为阳性。

1.5 统计学处理

采用SPSS 17.0软件进行数据分析。计量资料采用t检验分析组间差异；计数资料采用χ2检验或Fisher确切概率法分析组间差异；等级资料采用秩和检验分析组间差异。生存分析采用Kaplan-Meier法，生存差异采用log-rank检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 药物治疗情况

27例患者无一例获CR，接受奥沙利铂联合替吉奥化疗方案的16例患者（有2例患者完成该方案后进行替吉奥维持化疗），中位化疗周期数为2个周期（2～15个周期），获 PR 2例，SD 2例，疾病控制率为25.0%；接受索拉非尼治疗的11例患者，中位治疗时间为2.8个月（1.0～25.4个月），获PR 1例，SD 2例，疾病控制率为27.3%。

2.2 FPN1及DMT1在HCC癌组织中的表达

FPN1在HCC癌组织中的阳性表达率为62.96%（17/27），DMT1阳性表达率为81.48%（22/27）。见图 1。

图1 FPN1和DMT1在HCC癌组织中的表达

2.3 FPN1及DMT1表达与HCC患者临床病理特征的关系

FPN1和DMT1的表达在不同性别、年龄、HBV感染、血清铁蛋白水平、血清AFP水平、肿瘤最大直径、肿瘤数目、肝门淋巴结转移、包膜受侵、脉管癌栓等患者中的差异无统计学意义（P＞0.05），但在不同肿瘤分化程度患者间的表达差异有统计学意义（P＝0.02）。见表2。

表2 FPN1及DMT1的表达与HCC患者临床病理特征的关系（n）

（续表）

2.4 FPN1表达与HCC患者预后的关系

FPN1阳性与阴性表达者的DCR分别为41.2%和10.0%（P＝0.190），中位PFS分别为6.7个月和1.8个月（P＝0.002），见图2；中位OS分别为15.7个月和8.0个月（P＝0.005），见图 3。

2.5 DMT1表达与HCC患者预后的关系

DMT1阳性表达与阴性表达者的DCR分别为18.2%和 60.0%（P＝0.091），中位 PFS分别为 3.2个月和 18.6个月（P＝0.003），见图 4；中位 OS分别为 9.3个月和 35.9个月（P＝0.002），见图 5。

图2 FPN1表达与HCC患者PFS的关系

图3 FPN1表达与HCC患者OS的关系

图4 DMT1表达与HCC患者PFS的关系

图5 DMT1表达与HCC患者OS的关系

3 讨论

原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤，大部分患者确诊时已属中晚期，化疗及分子靶向药物是晚期肝癌患者的常用治疗手段，然而疗效有限。SHARP研究显示分子靶向药物索拉非尼较安慰剂仅能使晚期HCC患者总生存期延长约3个月［12］。Qin等［13］研究显示晚期HCC患者接受FOLFOX 4方案（奥沙利铂+5-氟尿嘧啶+亚叶酸钙）化疗，疾病缓解率仅从对照组（阿霉素单药化疗）的2.67%提高到8.15%，中位总生存期从4.97个月延长至6.40个月。因此研究HCC耐药机制并进行逆转是目前的热点与难点。

锰是人体必须的微量元素之一，是多种酶的组成成分及激活因子，其中尤为重要的是锰超氧化物歧化酶，其能催化线粒体内的超氧阴离子（）生成过氧化氢（H2O2）。H2O2、等ROS与恶性肿瘤的发生发展及凋亡机制有关。多数化疗药物及分子靶向药物索拉非尼须通过产生 ROS 以杀死癌细胞［8，14］。刘志辉［4］研究发现肝癌细胞内微量元素锰的含量影响了癌细胞对阿霉素的敏感性，因此，研究癌细胞锰元素含量的调控机制及其对肝癌药物治疗疗效的影响具有重要意义。

FPN1能将锰从细胞内转运至细胞外，DMT1则将锰转运至细胞内。已有研究显示FPN1及DMT1在肿瘤发生发展过程中可能扮演重要角色。Xue等［15］发现FPN1在前列腺癌组织中的表达量较增生的前列腺组织及正常的前列腺组织明显降低。Guo等［16］研究发现FPN1高表达可抑制裸鼠移植瘤中乳腺癌细胞的生长。Pinnix等［17］则发现FPN1低表达与乳腺癌患者无转移生存期有关，与雌激素受体缺失、高组织学分级、淋巴结转移等不良预后因素相关，对患者的预后有预测作用。有学者还发现FPN1在正常肝组织、癌旁组织表达呈强阳性，而在HCC细胞中大部分表达缺失或降低，且与肝内转移、门静脉浸润、Edmondson-Steiner高分级、TNM分期晚相关，认为FPN1低表达可能与HCC预后不良有关［18］。

Boult等［19］研究显示，在Barrett食管向腺瘤转化的过程中DMT1过度表达，且DMT1过表达与食管腺瘤远处转移相关。Brookes等［20］发现，DMT1在人结直肠癌细胞中过表达，且与患者肿瘤进展相关。吴学钦等［11］研究发现DMT1在肝癌组织中的阳性表达率较正常肝组织升高，且DMT1表达随肝癌分化程度降低而升高，提示DMT1在肝癌发生发展中可能起重要作用。

本研究结果显示HCC癌组织中FPN1阳性表达率为63.96%，DMT1阳性表达率达81.48%，二者与HCC分化程度有关，与前述其他学者的研究结果相似。FPN1与DMT1在HCC细胞不同的表达状态，可能造成癌细胞内锰元素含量存在差异，从而影响SOD2的活性水平，进而影响HCC药物治疗的效果。但本研究并未发现FPN1及DMT1表达状态与HCC患者化疗或索拉非尼治疗的DCR有关。这可能与细胞内ROS含量复杂的调控机制有关，需进一步研究。而本研究显示FPN1阳性患者PFS、OS较FPN1阴性患者延长，DMT1阴性患者PFS、OS较DMT1阳性患者延长，提示FPN1和DMT1可能与晚期HCC患者预后有关，其确切机制目前未见相关报道，值得进一步研究。

本研究亦存在一定局限性。首先，纳入分析的患者接受奥沙利铂联合替吉奥化疗或索拉非尼治疗，两种治疗方法的疗效可能存在差异，从而混淆了FPN1及DMT1表达对PFS和OS的影响。其次，样本量较小，未能通过COX风险比例模型分析FPN1及DMT1表达对PFS、OS的影响，因此，HCC组织中FPN1及DMT1的表达与药物治疗疗效的关系仍需进一步深入研究。

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Expression of FPN1 and DMT1 in hepatocellular carcinoma tissues and relationship with efficacy of chemotherapy or sorafenib

Qin Zhijun1，2，Huang Lu1，2，Zeng Xiaoyi1，2，Yang Weiping1，Liao Xiaoli1，Li Yongqiang1，Wei Changyuan1，Liu Zhihui1（1Department of Chemotherapy，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University；2Graduate School of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）

ObjectiveThe present study evaluated the expression of Ferroportin 1（FPN1）and transporter 1（DMT1）in cancer tissues of HCC patients and the potential relationship with clinico-pathological characteristics and efficacy of chemotherapy or sorafenib.MethodsClinical data were retrospectively reviewed for patients who experienced tumor recurrence or metastasis after radical resection and treated by chemotherapy or sorafenib，expression of FPN1 and DMT1 was analyzed in cancer tissues using immunohistochemistry and explored for possible correlation with clinico-pathological characteristics.ResultsFPN1 expression was detected in 62.96%of HCC tissues，and DMT1 expression was detected in 81.48%.Expression of each protein correlated significantly with extent of tumor differentiation（Plt;0.05）.Most patients （16）took chemotherapy consisting of oxaliplatin and S-1，while the remaining 11 took sorafenib.No patients experienced complete remission.Among patients receiving chemotherapy，partial remission occurred in 2 patients and stable disease in 2；altogether，this translated to a disease control rate of 25%.Among patients taking sorafenib，the corresponding numbers were 1，2 and 27.3%.Among all patients，median progression-free survival（PFS）was 5.4 months and median overall survival（OS）was 10.0 months.Among FPN1-positive patients，the disease control rate was 41.2%，median PFS was 6.7 months，and median OS was 15.7 months.The corresponding numbers among FPN1-negative patients were 10.0%，1.8 months and 8 months.Among DMT1-positive patients，the disease control rate was 18.2%，median PFS was 3.2 months，and median OS was 9.3 months.The corresponding numbers among DMT1-negative patients were 60.0%，18.6 months and 35.9 months.Both PFS and OS differed significantly between patients negative or positive for FPN1 or DMT1.ConclusionExpression of FPN1 and DMT1 in HCC cancer tissues is associated with tumor differentiation，and may influence HCC patient outcomes，which merits further study.

Liu Zhihui.E-mail：lzhh101@sina.com；Liao Xiaoli.E-mail：nllxl@163.com

Liver neoplasms；Ferroportin 1；Metal transporter 1；Chemotherapy；Targeted therapy；Sorafenib

R735.7

A

1674-5671（2017）05-06

10.3969/j.issn.1674-5671.2017.05.06

广西科学研究与技术开发计划资助项目（桂科AB16380215）；广西医疗卫生适宜技术研究与开发资助项目（S201418-03）；广西壮族自治区卫生厅自筹经费科研资助项目（Z2013423）

刘志辉。E-mail：lzhh101@sina.com；廖小莉。E-mail：nllxl@163.com

黄露为并列第一作者

［2017-08-03收稿］［2017-09-12修回］［编辑 罗惠予］