兔肉干挥发性风味分析

陈剑，蒋云升，闫婷婷，李华

兔肉干挥发性风味分析

陈剑，蒋云升，闫婷婷，李华

(扬州大学 食品科学与工程学院，江苏 扬州 225127)

利用汉逊氏德巴利酵母(Dabaryomyceshansenii)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)和木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)对兔肉进行接种，优化工艺制作肉干。采用顶空固相微萃取(HS-SPME)和气相色谱-质谱方法(GC-MS)研究复合发酵剂对兔肉干挥发性风味成分的影响。发酵温度16 ℃，接种量1×107cfu/g，发酵时间54 h，其中复合发酵组接菌比例(L∶C∶Y为1∶4∶1)试验条件下，检测到5个兔肉干样本的挥发性成分共135种，包括12种醛、32种烷、22种胡椒类、28种醇、7种酮、6种酸、14种酯和14种其他成分。通过对各发酵处理组的挥发性风味成分进行数据分析：不同的微生物发酵菌株对肉干的风味成分的种类和相对含量都有显著影响，酮类、胡椒类和其他类对复合发酵处理组风味产生影响最大，表明复合发酵处理是形成和改善兔肉干风味的优选方法。

兔肉干;挥发性风味;GC-MS;SPME;PCA分析

随着兔肉原料营养价值的深入研究和产业推广，兔肉的消费市场、消费需求持续性增长[1]。但是我国的兔肉消费形式中，80%是烹饪加工，20%是食品加工。按照业内加工四个等级的提法：第一级是初加工，就是屠宰后的冻兔肉；第二级是在初加工品基础上再加工，类似烤兔、板兔类的方法；第三级是指各类兔肉深加工，如微波食品、复合兔肉食品类；第四级指的是“食品加工社会化”。其中第一、二级属于初级，第三、第四级是精深加工[2]。兔肉精深加工食品所占比例：德国和美国均约为85%～90%、日本约为82%、欧盟约为60%～80%，而我国少于30%。

肉干是经腌制、干制而成的传统肉制品，具有色泽棕红、味道鲜实、甜中微咸、芳香浓郁、余味无穷的特点。兔肉干是营养健康的肉干食品家族的新成员。风味是肉干重要的质量指标，研究如何消除不良气味以及改善兔肉干风味有重要价值。目前针对食品风味物质的研究，尤其对肉类风味的研究越来越多，但是有关兔肉及其制品风味的研究相对较少。姜颖等[3]对兔肉腥味物质的提取与鉴定认为：兔肉腥味物质是以醛类成分为主导，两种卤代烃(1-氯十二烷和1-溴十三烷)可能是其特殊气味构成的关键因子。

发酵加工是兔肉精深加工形式。发酵兔肉干风味是其肉干风味成分作用于人的嗅觉、味觉感受器产生的综合体验感受。发酵兔肉干风味成分包括两类：一类是挥发类，另一类是非挥发类[4]。其风味成分来源主要有三个途径：一是微生物酶和组织酶降解脂肪、蛋白质、碳水化合物形成的风味成分；二是非生物途径反应所产生的风味成分(如脂肪自动氧化)；三是直接添加所形成的风味成分(如香辛料、盐等)。兔肉干生产过程中蛋白质、脂肪等物质发生了酶促或非酶变化，如蛋白质的酶解、Streker降解、脂肪水解、氧化以及美拉德反应等，这些综合反应共同作用渐渐形成了别具一格的风味特征。发酵可以导致风味变化，不同的发酵菌株会产生不同的风味成分。戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、结合木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)可以显著降低公蓄不良气味[5]。汉逊氏德巴利酵母菌(Dabaryomyceshansenii)影响到发酵肉干中蛋白质水解及风味形成[6]。

目前风味成分提取所常用的方法包括蒸馏萃取SDE、静态顶空、动态顶空、吹扫冷阱捕集以及固相微萃取SPME等[7]。SPME技术克服了传统预处理缺陷，无需使用复杂的装置和溶剂，可直接从固(液)体样品中采集挥发性成分，进而利用气相色谱GC、气相色谱-质谱联用GC-MS方法来分析[8]。本试验以3种微生物发酵剂和发酵剂组合加工而成的兔肉干产品为对象，运用GC-MS-SPME方法来探讨不同处理方法对发酵兔肉干主体风味成分的影响，寻求关键工艺的改进依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

市售新鲜兔肉，烹饪调味料包括鱼露、绵白糖、味精、胡椒粉、混合香料。植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)简称L菌种、木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)简称C菌种、汉逊氏德巴利酵母菌(Dabaryomyceshansenii)简称Y菌种，扬州大学食品与营养科学系实验室保存。

1.2 试验设备

Trace DSQ气质联用仪GC-MS，SUPELCO的复合式75 μm Car/PDMS萃取头，手动SPME进样器 美国Finnigan公司；SW-CJ-1F超净工作台 苏州净化设备有限公司；PYX-DHS恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂；YXQ.SGH280高压灭菌锅 上海医用核子器械厂。

1.3 发酵兔肉干加工

配方成分为新鲜兔肉500.0 g，白糖50.0 g，鱼露50.0 g，味精3 g，胡椒粉1 g，混合香料1 g。工艺步骤和流程包括：选料解冻→绞碎拌馅腌制(鱼露等调味0～5 ℃条件下腌制2 h)→添加发酵剂一次混匀→低温发酵→加香辛料再混匀→成型干燥→风干真空包装。

1.3.1 兔肉原料选择与解冻处理

选择符合国家食品卫生标准的冷冻兔后腿肉；冷冻肉室温解冻4 h至半解冻状态，去皮去骨去筋膜。

1.3.2 制作添加发酵剂

30 ℃液体培养基培养筛选菌株，12 h以后置于4 ℃条件下冷冻离心(4000 r/min)10 min，无菌生理盐水洗涤1次，离心收集菌体，适量稀释到指定添加分量。

1.3.3 拌料接种

控制好整个制作过程温度不高于4 ℃，预腌制的兔肉中拌入香辛料、不同种类发酵剂，搅拌均匀。在单因素试验、正交优化试验基础上，确定发酵处理兔肉干最佳工艺参数：发酵温度16 ℃，接种量1×107cfu/g，发酵时间54 h，其中S组的接菌比例L∶C∶Y为1∶4∶1。

在不同烘干温度条件下，烘干过程对色泽、水分、质构变化等方面资料。确定产品20%含水量最佳，将烘烤阶段的工艺条件设定为：在90 ℃烘烤0.5 h成型，65 ℃干制2 h。

1.4 不同发酵试验组说明

按发酵剂的使用情况将试验分为5个处理组，标记为L，C，Y，S和CK组。单独接种乳酸菌是L组，单独接种葡萄球菌是C组，单独接种酵母菌是Y处理组、S处理组复合菌种接种、CK组空白对照不接种。试验测定各组处理加工后成品中的挥发性化合物成分含量。

1.5 挥发性风味成分富集

参照Spaziani采用SPME、静态顶空固相微萃取(Headspace Solid Phase Microextraction)方法测定挥发性风味物质组分[9]。称取兔肉干样品20.00 g，均匀切碎，置入萃取瓶锡纸封口。插入复合式萃取头(75 μm Car/PDMS)，萃取头在萃取瓶内样品上部顶空，60 ℃水浴萃取1 h。萃取头插入气相色谱进样口250 ℃条件解吸2 min，抽回纤维头、拔出萃取头时启动仪器采集数据，重复3次试验。萃取头首次使用需先在气相色谱进样口250 ℃老化2 h，确保脱除可吸附气味之后的使用条件250 ℃解吸20 min。

1.6 挥发性风味成分的分离与鉴定

将萃取头插入GC-MS进样口250 ℃解吸2 min，纤维头抽回再拔萃取头，启动数据采集。

1.6.1 气谱条件

OV1701弹性石英毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.3 μm)的涂层Poly (dimthyldiloxy) poly(1,4-bis(dimethylsiloxy) phenylene) siloxane；氮气载气不分流，流速1.0 mL/min；进样口温度250 ℃；程序升温：40 ℃保持10 min，以3 ℃/min升至160 ℃，保持5 min。

1.6.2 质谱条件

气质联用仪以电子轰击方式运行，离子源为EI源，能量为70 eV，温度为250 ℃；发射电流为150 μA；检测器电压为350 V；扫描范围为40～500 amu；接口温度为160 ℃。

1.6.3 定性

检索匹配NIST数据库 (170k compounds)，相似指数(SI>800)为确认化合物(最大值1000)。定量：各挥发性风味成分的相对百分含量按其在总离子图的峰面积归一化，用SAS分析试验数据。

2 结果与分析

CK对照组和L，C，Y，S处理组，不同处理对兔肉干中的挥发性风味成分总离子图谱见图1。挥发性风味成分的分析结果见表1。

图1 发酵兔肉干风味成分的总离子流图Fig.1 Total ion chromatograms of flavor compounds of fermented rabbit jerky

续 表

续 表

续 表

注：“-”为未检测到。

由表1可知，试验共检测到135种挥发性风味成分，包括12种醛、32种烷、22种胡椒类、醇28种、酮7种、酸6种、酯14种、其他14种。

接种不同微生物发酵剂，使得兔肉干挥发性风味成分，也包括其含量，对照空白组都发生了显著而复杂的变化。空白对照组检测到51种风味成分，包括醛3种、烷17种、胡椒类9种、醇8种、酮2种、酸1种、酯9种、其他2种。L处理组检测到挥发物质53种，包括醛4种、烷8种、胡椒类13种、醇14种、酮2种、酸3种、酯4种、其他5种。C发酵处理组共检测风味成分34种，包括醛7种、烷2种、胡椒类11种、醇5种、酮2种、酸1种、酯3种、其他3种。Y处理组检测到风味成分50种，包括醛7种、烷8种、胡椒类17种、醇10种、酮1种、酯类3种、其他4种，酸类未检出。S处理组兔肉干检测到风味成分38种，包括醛7种、烷6种、胡椒类10种、醇7种、酸2种、酯3种、其他成分3种，酮未检到。

2.2 不同处理条件风味成分总峰面积数据处理

各种挥发性风味成分相对百分含量，根据其所在总离子图，峰面积归一化处理的结果见表2。

表2 不同处理组兔肉干挥发风味成分Table 2 Volatile flavor compounds in different fermented rabbit jerky samples

由表2可知，CK组总峰面积醛类>胡椒类>烷类>醇类。L处理组总峰面积胡椒类>醇类>醛类>其他类。C处理组总峰面积醛类>胡椒类>酯类>醇类。Y处理组总峰面积胡椒类>醇类>醛类>其他类。S处理组总峰面积醛类>胡椒类>醇类>酯类。

乳酸菌接种组和复合菌种处理组中全部风味成分总峰面积均高于CK组，葡萄球菌处理组除烷类外，各类风味成分总峰面积均高于CK组，特别是醛类为CK组的1.5倍。复合菌种处理组中醛类为CK组的1.4倍。乳酸菌处理组中胡椒类、醇类、酸类和其他项总峰面积均高于CK组，乳酸菌和复合菌种处理组的胡椒类是CK组的1.75倍。酵母菌和葡萄球菌处理组胡椒类总峰面积也远高于CK组，而且两处理组胡椒类成分的个数也远高于CK组。

2.3 各处理组风味物质主成分分析

定性分析挥发性风味成分，确定发酵兔肉干中主体风味物质。参照邓祖新[10]的主成分分析方法(Principal Component Analysis，PCA)，结果见表3和表4。

表3 各处理组发酵兔肉干风味的PCA结果Table 3 The results of PCA on flavor of fermented rabbit jerky

前3个主成分特征值提取信息量达91%(累计贡献率)，因此取前3个主成分。

表4 PCA方法对处理兔肉干组的影响Table 4 Effect of PCA method on fermented rabbit jerky

由表4可知，葡萄球菌处理组F1值较大，体现正载荷在兔肉干风味中所占比例较重，如醛类、酮类、酯类和其他。而CK组、乳酸菌处理组和复合菌种处理组的值接近0，体现各种风味物质在兔肉干风味形成的过程中所占比例较接近。第二主成分在胡椒类和酸类这两个因子上存在着较高的正载荷。而乳酸菌处理组和复合菌种处理组的F2值较高，也就是说乳酸菌处理组和复合菌种处理组中胡椒类和酸类的分量较重，其他类也对兔肉干风味产生较大影响。第三主成分在醇类和酮类两个因子上存在着较高正载荷。而乳酸菌处理组和酵母菌处理组的F3值较高，就是说乳酸菌处理组和酵母菌处理组的风味中其他类和酮类的分量较重，醇类也对兔肉干风味产生较大影响。

2.4复合发酵处理对发酵兔肉干挥发性风味物质的影响

Dirinck等[11]认为脂肪水解以及脂肪氧化过程中，产生小分子脂肪酸或氨基酸脱氨反应，可能源自微生物作用产生酸类。酸可能源于磷脂与中性脂肪降解亦或氨基酸脱氨，而存在一些低分子的酸类，更有证据表明其源自微生物作用。本项目试验各组样品检测出的脂肪酸的种类和含量均较少，以短链脂肪酸为主，各处理酸的总峰面积均高于CK组，乳酸菌处理组酸种类和总峰面积均更加显著地高于CK组，能揭示植物乳杆菌(L.plantarum)的较强产酸能力。

醛是发酵兔肉干风味成分中最重因子，因其很低的阈值，对发酵处理的兔肉干风味贡献巨大。芳香醛主要源自芳香族氨基酸Strecke降解，而直链醛源自酯类物质氧化[12]。本试验中，葡萄球菌处理组醛总峰面积高于其他组，葡萄球菌处理过程产生大量的醛，具有浓烈的醛香味，可能是因为木糖葡萄球菌(S.xylosus)产生大量蛋白酶和酯酶，使该处理中风味前体物质数量大为增加。苯甲醛呈令人愉快的水果香、杏仁香和坚果香，壬醛呈现的青草香味或许是发酵处理兔肉干风味之特征。直链己醛具有青草清香味，检出量远小于芳香醛，但因其风味阈值极低，也可能对发酵兔肉干风味起重大影响[13]。

酵母菌处理组兔肉干醇类的总峰面积显著高于其他组别。酵母菌能利用葡萄糖产生醇类。直链低级醇相对来说是无风味的，除非它们具有较高的含量或者是非饱和醇[14]。最具代表性的不饱1-辛烯-3-醇是酯类氧化产物，有明显的蘑菇味，低阈值；己醇有“青草味”；庚醇有“土豆味”，对发酵肉制品风味的形成都具有重要影响。另外3-甲基丁醇可能来自相应醛的降解[15]。

复合发酵处理兔肉干的胡椒类和醛类的总峰面积显著高于CK处理。胡椒类物质大多数属于萜类物质，主要源自发酵兔肉干添加了胡椒，对发酵兔肉干的风味有重要影响，挥发性风味物质的种类与国内外相关研究报道基本一致，但含量有所差异。

3 结论

乳酸菌处理组发酵兔肉干的胡椒类总峰面积最高，其次是醇类、醛类和其他，PCA分析方法表明胡椒类、酸、酮和其他类对乳酸菌处理发酵兔肉干风味产生较大的影响。葡萄球菌处理组发酵兔肉干的醛类的总峰面积最高，其次是胡椒类、酯类和醇类，PCA分析方法表明醛、酮、酯对葡萄球菌处理组发酵兔肉干风味的影响更大。酵母菌处理组发酵兔肉干的胡椒类总峰面积最高，其次是醇类、醛类和其他，PCA分析方法表明酵母菌处理组发酵兔肉干中酮、醇、其他的比重更大一些，对其风味产生较大的影响。复合发酵处理兔肉干的醛类总峰面积最高，其次是胡椒类、醇类和酯类，PCA分析方法表明复合菌种组风味中胡椒类、酸类和其他的分量较重，对其风味影响重大。

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AnalysisofVolatileFlavorCompoundsofRabbitJerky

CHEN Jian, JIANG Yun-sheng, YAN Ting-ting, LI Hua

(College of Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China)

In this paper,Debaryomyceshansenii,Lactobacillusplantarum,Staphylococcusxylosusare inoculated into rabbit meat by different strains modes.Rabbit jerky is made after fermentation and drying. The volatile compounds of rabbit jerky are extracted by headspace solid-phase microextraction (HS-SPME) and separated and identified by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Fermentation temperature is 16 ℃, inoculation amount is 1×107cfu/g, fermentation time is 54 h.Under the experimental conditions of proportion of composite fermentation group (L∶C∶Y = 1∶4∶1),a total of 135 species of volatile components are detected in 5 rabbit jerky samples, including 12 aldehydes, 32 alkanes, 22 peppings, 28 alcohols, 7 ketones, 6 acids, 14 esters and 14 other ingredients. By analyzing the volatile flavor components of each fermentation group, different microbial fermentation strains have a significant effect on the type and relative content of the flavor components of the jerky, and the ketone, pepper and other types have the most significant effect on the flavor of composite fermentation group, indicating that the composite fermentation treatment is the preferred method for forming and improving the flavor of rabbit jerky.

rabbit jerky；volatile flavor compounds；gas chromatography-mass spectrometry；solid-phase microextraction；principal component analysis

TS201.2

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.11.023

1000-9973(2017)11-0103-07

2017-05-11

肉类加工四川省重点实验室开放基金项目(15-R11)；江苏省科技厅科技支撑计划项目(BE2012139)

陈剑(1977-)，男，讲师，硕士，研究方向：食品卫生与营养学；

蒋云升(1962-)，男，教授，研究方向：食品生物技术。