松墨天牛NCOA7基因的克隆及分析

刘琪司，陈敬祥，林 同*

(1.广州市林业和园林有害生物防治检疫管理办公室,广东 广州 510060；2.华南农业大学林学与风景园林学院，广东 广州 510642)

松墨天牛NCOA7基因的克隆及分析

刘琪司1，陈敬祥2，林 同2*

(1.广州市林业和园林有害生物防治检疫管理办公室,广东 广州 510060；2.华南农业大学林学与风景园林学院，广东 广州 510642)

【目的】本文探究了松墨天牛核受体共激活因子7基因的功能和作用方式。【方法】采用cDNA末端快速扩增(RACE)方法获得了松墨天牛NCOA7基因的cDNA全长序列，命名为MaNCOA7 (GenBank登录号：KU240004) ；通过RT-qPCR分析得出松墨天牛MaNCOA7 基因在卵、幼虫、蛹、成虫4个虫态、幼虫脂肪体等6个组织和成虫鞘翅等10个部位的表达模式。【结果】MaNCOA7基因的cDNA序列全长为3345 bp，其中开放阅读框(ORF) 长2970 bp，编码989个氨基酸，由此推测的蛋白分子质量为111 220.4 ku，等电点为5.11。MaNCOA7的氨基酸序列与赤拟谷盗相似性最高，为83.6 %，与赤拟谷盗处在系统发育树的同一个分支上；没有信号肽和跨膜区，属于亲水性氨基酸，含有丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)磷酸化位点数分别为62、21、11 个。MaNCOA7基因在幼虫虫态表达量最高，在卵虫态表达量最低；在幼虫6个组织中均有表达，且有显著差异(P< 0.05)，其中在幼虫脂肪体中表达量最高，在幼虫马氏管中表达量最低；在成虫10个部位中均有表达，且有显著差异(P< 0.05)，其中在成虫鞘翅的表达量最高，在成虫马氏管的表达量最低。【结论】推测MaNCOA7基因在松墨天牛幼虫脂肪体中参与调控某些代谢过程或组织器官的生理功能，并可能参与了松墨天牛羽化过程中鞘翅和前胸背板的骨化过程。

松墨天牛；核受体共激活因子7；基因克隆；RT-qPCR；基因表达模式

【研究意义】松墨天牛(Monochamusalternatus)，属鞘翅目(Goleoptera)，天牛科(Cerambycidae)，为有“森林癌症”之称的松材线虫病Bursaphelenchusxylophilus的主要媒介昆虫，对马尾松等针叶树种危害严重[1-2]。核受体是生物体内最丰富的转录因子超家族之一，核受体与其配体及众多共激活因子相互作用的基因网络的协调表达共同调控机体的生长发育、细胞分化、生理及代谢过程[3]。核受体共激活因子7 (nuclear receptor coactivator 7, NCOA7) 是一种雌激素受体蛋白[4]，可以保护细胞DNA 氧化损伤[5-8]。【前人研究进展】核受体调节转录，直接对其同源的激素配体进行反应，配体结合激活共激活体，通过内在的组蛋白修饰，重塑染色质。此外，配体结合的复合物直接地作用于转录过程，这表明核受体的转录调节可能涉及到染色质的改变，是调节启动子的关键启动组件[9]。核受体共激活因子通过参与一系列的酶活动，如乙酰化，甲基化，泛素化，磷化，或染色质重塑能引起增强的基因表达，除了参与调节启动子外，广泛参与从细胞核的mRNA转运、mRNA翻译和合成蛋白的转录后修饰[10]。研究认为，NCOA7对鸡胚胎发育期的肌肉组织肌管发育和肌纤维形成可能有一定的促进作用，并可能对出生后鸡肌肉的发育具有一定的负调控作用[11]。目前尚未见昆虫NCOA7基因研究的相关报道。【本研究切入点】本研究从已构建的松墨天牛cDNA 文库[12]中筛选出一条带有5'末端的NCOA7基因序列，用RACE方法扩增了3'末端；经拼接获得了这一基因的cDNA全长序列，并对其生物学特性和表达模式进行了分析。【拟解决的关键问题】该研究以期为深入研究该基因在松墨天牛中的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

本试验使用的主要试剂见表1。

1.2 总RNA的提取与cDNA的合成

采用试剂盒法提取松墨天牛幼虫、成虫mRNA，通过1.5 %琼脂糖凝胶电泳检测mRNA 的提纯质量，并用微量紫外分光光度仪 (Nanodrop 2000) 对其纯度进行检测并对其定量后，将检测结果符合后续实验要求的样品暂存在-80 ℃超低温冰箱供后续实验使用。按 PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser反转录试剂盒说明书对上述mRNA样品进行反转录反应，将得到的第一链cDNA样品暂存于-20 ℃冰箱，用于后续3' RACE实验。

1.3 引物设计和3'RACE扩增

通过GenBank数据库Blast比对从本实验室所构建的松墨天牛cDNA文库[12]中筛选出一条与昆虫NCOA7相似的带有完整5'末端的序列。用primer premier 5.0设计该序列的特异性引物用于3' RACE (MaNCOA7 Outer: GGAAATGGACACAGAGC; MaNCOA7 Inner: TCTTCAGCACCAGCCAG)，引物合成由上海生物工程有限公司完成。

结合3′-Full RACE Core Set with Prime Script TM RTase试剂盒提供的2个下游引物进行巢式PCR反应。根据试剂盒使用说明书方法，首先进行Outer PCR扩增，反应条件为：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，20 cycles，72 ℃ 10 min。然后进行Inner PCR扩增，反应条件为：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 cycles，72 ℃ 10 min。通过1.5 % 琼脂糖凝胶电泳对PCR产物的片段大小及样品纯度进行分析后，对目的片段进行纯化回收，并将纯化回收产物与pMD20-T 载体连接，转化大肠杆菌后，挑选阳性克隆样品送上海生物工程有限公司测序得到正确的重组子。

1.4 推测的编码蛋白特性分析

对拼接后的序列查找其开放阅读框(ORF) ，对其进行相似性比对分析、计算蛋白质的等电点与分子量、预测蛋白质信号肽、磷酸化修饰位点和糖基化修饰位点、分析蛋白质疏水性和跨膜结构域。具体蛋白质特性分析途径见表2。

表1 实验试剂

表2 蛋白质特性分析途径

1.5 系统发育树构建

使用DNAMAN软件对从NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) GenBank数据库中检索得到的所有昆虫NCOA 7氨基酸序列进行同源性比对，并应用Clustal X和MEGA 4.0软件通过NJ法对昆虫NCOA 7构建系统发育树。

1.6 RT-qPCR

应用primer premier 5.0软件在MaNCOA7基因ORF范围内设计一对特异性引物MaQ F: 5′-GTGGAAATGGACACAGAGC-3′和MaQ R:5′-CGTGAAGGTGAATAAGGAG-3′用于RT-qPCR。采用RT-qPCR(SYBR Green)，以微管蛋白基因(β-actin)作为内参基因，以无菌超纯水作为阴性对照，以MaNCOA7基因在松墨天牛卵的表达量作为标准参量，检测MaNCOA7基因在幼虫、蛹、成虫各虫态的表达模式；分别以松墨天牛幼虫和成虫的表达量作为标准参量，分别检测MaNCOA7基因在幼虫各组织和成虫各部位的表达模式。使用罗氏LightCycler480荧光定量PCR 仪进行上述RT-qPCR反应，设置cDNA样品各3次重复，反应程序为: 95 ℃预变性 30 s；Quantification: 95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40 cycles；Melting curves: 95 ℃ 1 s，65 ℃ 15 s；Cooling: 40 ℃ 30 s。反应结束后利用2-ΔΔCt相对定量法计算目标基因的表达模式。

2 结果与分析

2.1 MaNCOA7特性分析

将3′ RACE测序结果与已知序列片段拼接获得松墨天牛NCOA7基因的cDNA全长序列，命名为MaNCOA7 (GenBank登录号: KU240004) ，全长3345 bp，其中开放阅读框(ORF)长2970 bp，编码989个氨基酸(图1)，推测的蛋白分子质量为111 220.4 ku，等电点为5.11。

跨膜区域分析结果显示，MaNCOA7蛋白在膜外，不存在跨膜区域，亦无信号肽。预测MaNCOA7的磷酸化修饰位点共有94个，其中丝氨酸(Ser)磷酸化位点、苏氨酸(Thr)磷酸化位点和酪氨酸(Tyr)磷酸化位点分别有62、21和11个，这些位点在整个多肽链中呈现均匀分布。NetOGlye预测表明，MaNCOA7在164、217、312、921氨基酸位点存在N-糖基化修饰。疏水性分析表明在MaNCOA7的300～350氨基酸位有一个明显的疏水性区域，但在整个多肽链中，亲水性氨基酸多于疏水性氨基酸，因此MaNCOA7属于亲水性氨基酸。

2.2 同源性比对及进化树构建

MaNCOA7与赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)等15种昆虫的NCOA7氨基酸序列同源性比对结果见表3，可见MaNCOA7与赤拟谷盗的同源性最高，为83.6 %，与其它14种昆虫的同源性介于45 %～55 %。基于这15种昆虫NCOA7所构建的系统发育树表明：松墨天牛与赤拟谷盗处在系统发育树的同一个分支上，与其余昆虫遗传距离相对较远(图2)。这一结果与这些昆虫的分类地位是一致的。

2.3 MaNCOA7 的表达模式

通过RT-qPCR分析MaNCOA7 在松墨天牛4个虫态、幼虫6个组织和成虫10个部位的表达模式，结果表明:MaNCOA7 基因在松墨天牛幼虫虫态中的表达量最高，在卵虫态中的表达量最低，在松墨天牛蛹虫态和成虫虫态中的表达量分别是在松墨天牛卵虫态中的表达量的1.21和1.34倍，基因表达水平在4个虫态之间有显著差异(P< 0.05，图3)。

MaNCOA7 基因在松墨天牛幼虫各组织中的表达模式为：在脂肪体中的表达量最高，为对照的5.5倍；其次为在头部的表达量，是对照的2.55倍；在体壁和中肠中的表达量相同，同为对照的1.69倍。MaNCOA7 在上述4个幼虫组织中的表达量高于对照。该基因在马氏管中的表达量最低，为对照的0.91倍。基因在幼虫各组织中的表达有显著差异(P< 0.05，图4)。

起始密码子表示为下划波浪线，终止密码子表示为*，特异性引物outer表示为单下划线，特异性引物inner表示为双下划线，苏氨酸磷酸化位点以矩形表示，丝氨酸磷酸化位点以圆形表示，酪氨酸磷酸化位点以三角形表示，糖基化位点以加粗字体表示，疏水性区域以灰色字符底纹突出显示The translation start codon ‘ATG’ is marked with a wavy underline; The stop codon ‘TAA’ is marked with an asterisk; The specific primers outer is marked with a single underline and the specific primers inner is underlined with double line; The threonine phosphorylation sites, serine phosphorylation sites and p-hydroxyphenylalanine sites are marked with squares, rounds and triangles, respectively; The glycosylation sites are marked in bold; The hydrophobic region is highlighted by gray character shading图1 MaNCOA7的核苷酸和氨基酸序列Fig.1 MaNCOA7 nucleotide and amino acid sequences

中文名称学名分类地位与MaNCOA7的同源性(%)赤拟谷盗Triboliumcastaneum鞘翅目83.60毁侧沟茧蜂Microplitisdemolitor膜翅目54.62子弹蚁Dinoponeraquadriceps膜翅目54.55毕氏粗角猛蚁Cerapachysbiroi膜翅目54.26苜蓿切叶蜂Megachilerotundata膜翅目53.19丽蝇蛹集金小蜂Nasoniavitripennis膜翅目52.52红火蚁Solenopsisinvicta膜翅目51.93新疆菜叶蜂Athaliarosae膜翅目51.32法老小家蚁Monomoriumpharaonis膜翅目50.54小火蚁Wasmanniaauropunctata膜翅目50.54切叶蚁Attacephalotes膜翅目50.16弓背蚁Camponotusfloridanus膜翅目49.65短管赤眼蜂Trichogrammapretiosum膜翅目48.57麦茎蜂Cephuscinctus膜翅目45.46瓜实蝇Bactroceracucurbitae双翅目45.79

图2 基于16种昆虫的NCOA7基因氨基酸序列所构建的系统发育树Fig.2 Phylogenetic relationships of based on 16 insects NCOA7

图3 MaNCOA7基因在松墨天牛4个虫态的表达模式Fig.3 MaNCOA7 expression pattern in 4 Monochamus alternatus stages

图4 MaNCOA7基因在松墨天牛幼虫6个组织的表达模式Fig.4 MaNCOA7 expression pattern in 6 Monochamus alternatus larva parts

MaNCOA7 基因在松墨天牛成虫各部位中的表达模式为: 在鞘翅中的表达量最高，是对照的58.49倍；其次是在前胸中的表达量，为对照的34.54倍；

图5 MaNCOA7基因在松墨天牛成虫10个部位的表达模式Fig.5 MaNCOA7 expression pattern in 10 Monochamus alternatus adult parts

该基因在上述2个成虫部位中的表达量显著高于其在其它成虫部位中的表达量。除上述2个成虫部位外，该基因还在成虫的中肠、具翅胸、腹部、足和触角中的表达量高于对照。MaNCOA7 基因在马氏管中的表达量最低，为对照的0.78倍，除此之外，其在成虫头部和卵巢中的表达量亦均低于对照，分别为对照的0.83和0.81倍。在各部位间，MaNCOA7基因表达差异显著(P< 0.05，图5)。

3 小 结

本研究采用RACE技术得到松墨天牛核受体共激活因子7基因，这是在松墨天牛中发现的第一个NCOA7，对其进行了相似性比对分析、蛋白质的等电点与分子量计算、蛋白质信号肽、磷酸化修饰位点和糖基化修饰位点预测、蛋白质疏水性和跨膜结构域分析，并通过RT-qPCR分析得出松墨天牛MaNCOA7 基因在卵、幼虫、蛹、成虫4个虫态、幼虫脂肪体等6个组织和成虫鞘翅等10个部位的表达模式。

对MaNCOA7基因的生物信息学分析表明，该基因的cDNA序列全长为3345 bp，其中开放阅读框(ORF) 长2970 bp，编码989个氨基酸，由此推测的蛋白分子质量为111 220.4 ku，等电点为5.11。MaNCOA7的氨基酸序列与赤拟谷盗相似性最高，为83.6 %，与赤拟谷盗处在系统发育树的同一个分支上；没有信号肽和跨膜区，属于亲水性氨基酸，含有丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)磷酸化位点数分别为62、21、11 个。

对MaNCOA7基因表达模式的实验结果显示，MaNCOA7基因在幼虫虫态表达量最高，在卵虫态表达量最低；在幼虫6个组织中均有表达，且有显著差异(P< 0.05)，其中在脂肪体中表达量最高，马氏管中表达量最低；在成虫各部位均有表达，且有显著差异(P< 0.05)，其中在鞘翅的表达量最高，马氏管的表达量最低。

4 讨 论

同源比对分析表明，MaNCOA7与其它昆虫NCOA7同源一致性介于45 %～85 %，说明NCOA7亚型具有多样性。系统发育树中各目昆虫的NCOA7最后均各自汇聚为一支，表明NCOA7可能在不同目的昆虫中发挥不同的功能。MaNCOA7与赤拟谷盗NCOA7同源相似性最高，且二者在系统发育树汇聚为一支，表明MaNCOA7最有可能与赤拟谷盗NCOA7来自同一祖先基因，并在这两种昆虫中行使相似的功能。

蛋白质翻译后修饰通过使蛋白质的结构更加复杂，达到完善蛋白质功能，使蛋白质作用更专一，调节能力更强大的效果[13]。N-糖基化位点是了解糖链功能的基础，而糖基化在蛋白的翻译调控、信号传导以及细胞免疫和蛋白降解等生物过程中均起着重要的作用[14]。蛋白质磷酸化作用于细胞信号转导[15]。真核生物主要通过丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸等氨基酸残基的磷酸化广泛调节细胞的信号因子释放、基因表达、蛋白合成、能量储存、形态变化、肌肉收缩和生化代谢等功能[16]。本研究中糖基化位点预测显示MaNCOA7氨基酸序列中存在4个N-糖基化修饰位点，分别位于164、217、312、921氨基酸位点；预测到MaNCOA7的丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)磷酸化位点数分别为62、21、11 个，据此推测MaNCOA7可能在上述功能中发挥作用。

NCOA7属于雌激素受体蛋白[4]，是核受体超家族成员之一。核受体是生物体内最丰富的转录因子超家族之一，核受体与其配体及众多共激活因子相互作用的基因网络的协调表达共同调控机体的生长发育、细胞分化、生理及代谢过程[3]。本研究分析了MaNCOA7 基因的表达量，显示其在各龄期、幼虫各组织和成虫各部位广泛表达，暗示该基因可能参与松墨天牛机体的生长发育、细胞分化以及体内某些特定的生理、代谢过程的调控。

探究MaNCOA7在松墨天牛幼虫各组织中的表达模式发现，该基因在脂肪体中的表达量显著高于在其它组织中的表达量。脂肪体是昆虫生命代谢活动的中心组织，是多种激素作用的靶组织,它强烈地影响昆虫体内各个组织器官的生理功能[16]。由此可推测MaNCOA7在松墨天牛幼虫脂肪体中参与调控某些代谢过程或组织器官的生理功能。

在分析松墨天牛成虫各部位MaNCOA7表达模式中发现，鞘翅和前胸的表达量显著高于其它各部位[17]。还发现MaNCOA7在蛹中的表达量显著低于成虫，可能的原因是：鞘翅目昆虫鞘翅和前胸背板高度骨化，根据观察，松墨天牛蛹期尚无明显骨化现象，在羽化之后鞘翅、前胸背板骨化过程基本完成，因而推想该基因可能参与了松墨天牛羽化过程中鞘翅和前胸背板的骨化过程。

本研究使首次研究松墨天牛NCOA7基因，该基因在昆虫领域鲜有文章报道，故有待进一步深入研究才能充分证明推测和预测的可靠性。依据本研究的推想，后续实验拟对松墨天牛每日龄的蛹及初羽化成虫进行MaNCOA7 基因的表达量检测，以确定MaNCOA7在蛹和初羽化成虫中的动态表达模式；对松墨天牛蛹和初羽化成虫MaNCOA7进行RNA干扰，并结合RT-qPCR以及电镜观察等确定该基因是否与松墨天牛鞘翅、前胸的骨化过程相关并深入研究MaNCOA7在松墨天牛鞘翅骨化过程中的作用机理。

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CloningandAnalysisofNuclearReceptorCoactivator7GenefromMonochamusalternatus

LIU Qi-si1, CHEN Jing-xiang2, LIN Tong2*

(1.Guangzhou Forestry and Landscape Pest Control and Quarantine Office，Guangdong Guangzhou 510060, China 2.College of Forestry and Landscape Architecture, South China Agricultural University, Guangdong Guangzhou 510642, China)

【Objective】In this paper, the function and mode of nuclear receptor coactivator 7 gene inMonochamusalternateswere studied.【Method】A full length sequence ofNCOA7 designated asMaNCOA7 (GenBank: KU240004) fromMonochamusalternatuswas cloned by RACE (rapid-amplification of cDNA ends) method, and the expression pattern ofMaNCOA7 in different stages and different parts of both larvae and adults ofMonochamusalternatuswere detected by RT-qPCR.【Result】The full-length cDNA ofMaNCOA7 was 3345 bp, which contained a 2970 bp open reading frame (ORF),encoding 989 amino acids, with a calculated molecular mass of 111 220.4 ku and an isoelectric point of 5.11. The MaNCOA7 indicated the highest homology withTriboliumcastaneum(83.6 %),andM.alternatusandT.castaneumwere on the same branch in the phylogenetic tree;The MaNCOA7 protein was hydrophilic, without the signal peptide and transmembrane helices, and there were serine, threonine and p-hydroxyphenylalanine phosphorylation at 62, 21 and 11 sites in MaNCOA7, respectively. The expression pattern ofMaNCOA7 detected by RT-qPCR indicated that the expression level ofMaNCOA7 in larvae was the highest, and the lowest in eggs;MaNCOA7 was prominently expressed in all of the larvae and adults parts (P< 0.05)．The expression level in larvae fat-body and adults elytra were the highest while the lowest were in both larvae and adults Malpighian tubes (P< 0.05).【Conclusion】It is speculated that theMaNCOA7 gene participate in the regulation of certain metabolic processes or physiological functions of tissues and organs in the fat bodies ofMonochamusalternateslarvae and may be involved in the process of the ossification of elytron and pronotum ofMonochamusalternates.

Monochamusalternates;NCOA7; Gene cloning; RT-qPCR; Gene expression pattern

1001-4829(2017)10-2256-07

10.16213/j.cnki.scjas.2017.10.017

2016-09-20

国家自然科学基金(31470653)；广东省自然科学基金(1414050001666)

刘琪司(1993-)，女，广东兴宁人，硕士研究生，主要研究方向：昆虫分子生物学，E-mail：949082502@qq.com，Tel：13724043273；*为通讯作者，林 同，E-mail：lintong@scau.edu.cn。

S763.38;Q785

A

(责任编辑 陈 虹)