晚期肺癌外周血调节T细胞及CD8+T细胞表面PD—1表达的关系

郑玉军+王明吉+王雷+代璐璐+李颜君

【摘要】 目的 探讨晚期肺癌患者外周血中淋巴细胞亚型表面程序性死亡受体1（PD-1）的表达水平。方法 30例晚期肺癌患者， 采用流式细胞仪检测外周血中CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD4+CD25+T细胞（调节性T细胞， Tregs）及CD8+T细胞表面PD-1（CD8+CD279+T）百分比， 并与30例健康人的血液标本进行对比。结果 与健康人比较， 晚期肺癌患者CD4+及CD4+/CD8+T细胞水平有所降低， 但差异无统计学意义（P>0.05）；晚期肺癌患者CD8+T细胞水平为（27.70±12.87）%， CD8+CD279+T细胞水平为（2.03±1.35）%较健康人的（22.67±5.88）%、（1.26±0.83）%显著升高， 差异有统计学意义（P<0.05）；晚期肺癌患者CD4+CD25+T细胞数量（2.01±1.26）%显著高于健康人（0.98±0.55）%， 差异有统计学意义（P<0.05）。结论 晚期肺癌外周血CD4+CD25+T细胞数量显著高于健康人。

【关键词】 晚期肺癌；外周血；淋巴细胞亚型百分比

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.26.008

【Abstract】 Objective To investigate the expression level of programmed peripheral death receptor-1 （PD-1） in peripheral blood lymphocyte subtype of patients with advanced lung cancer. Methods The percentage of CD4+， CD8+， CD4+/CD8+， CD4+CD25 + T cells （regulatory T cells， Tregs） and percentage of PD-1 （CD8+CD279+T） on CD8+T cells surface in peripheral blood of 30 patients with advanced lung cancer were detected by flow cytometry， and they were compared with 30 cases of healthy blood samples. Results Compared with healthy people， patients with advanced lung cancer had lower CD4+， CD4+/CD8+T cell level， but the difference was not statistical significant （P>0.05）. Patients with advanced lung cancer had higher CD8+T cell level as （27.70±12.87）% and CD8+CD279+T cell level as （2.03±1.35）% than （22.67±5.88）% and （1.26±0.83）% in healthy people， and the different was statistically significant （P<0.05）. Patients with advanced lung cancer had obviously higher number of CD4+CD25+T cell as （2.01±1.26）% than （0.98±0.55）% in healthy people ， and the different was statistically significant （P<0.05）. Conclusion The number of CD4+CD25+T cells in peripheral blood of patients with advanced lung cancer is significantly higher than that of healthy people.

【Key words】 Advanced lung cancer； Peripheral blood； Percentage of lymphocyte subtype

肺癌已成为发病率和病死率增长最快、对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤， 晚期肺癌5年生存率仅有10%～15%。恶性肿瘤的发生、发展与机体免疫系统密切相关， 尤其是与免疫调节功能紊乱有关。尽管最近临床发现应用阻断细胞毒T淋巴细胞抗原4（CTLA4）[1]及PD-1[2]的抗体对转移性肿瘤进行免疫治疗， 可以获得持久的缓解， 但针对免疫抑制状态的治疗有效率最高也只有20%左右。另外， 也有研究显示， 肺癌基因突变负荷或联合免疫标志物的检测可能预测患者可能从PD-1的抑制中获益[3， 4]， 本文根据白细胞表面抗原分化簇（clusters of differentiation， CD）， 以健康成年人作對照， 以期为肺癌提供进一步的预后及疗效预测标志。现报告如下。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 因本院肺癌病例尚不充足， 故仅收集30例2014年8月～2016年8月在大连市友谊医院住院治疗的局部晚期或转移性肺癌， 其中男16例， 女14例；年龄46～86岁， 中位年龄70岁；排除严重感染性疾病或自身免疫性疾病患者。另选取同期来本院体检的30例健康成年人作为对照， 年龄、性别均与肺癌患者匹配。对全部肺癌患者进行电话随访， 随访截止日期为2016年8月10日， 19例尚未出现事件， 无失访者。

1. 2 肿瘤分期及分类 所有研究病例均经纤维支气管镜、肿块穿刺活检及手术明确诊断为肺癌， 排除严重感染性疾病或自身免疫性疾病患者。肿瘤分期根据纤维支气管镜、胸部CT、B超等检查结果， 采用国际抗癌联盟（international union against cancer， UICC）2010年肺癌第7版的TNM分期标准；病理类型采用2004年WHO肺癌病理分类。30例局部晚期不可手术及转移性肺癌， 包括ⅢC期8例、Ⅳ期22例；鳞癌4例， 腺癌13例， 小细胞肺癌4例， 大细胞癌1例， 未知8例。对化疗患者2 周期后再评估外周血细胞亚群（1例）。endprint

1. 3 测定方法

1. 3. 1 样品收集 抗凝全血2 ml摇匀；取两个1.5 ml EP管中分别加入100 μl全血， 其中一管作为NC对照不加抗体， 其余操作步骤一致；实验管中加入细胞表面抗原抗体CD4、CD8、CD25、CD279后混匀， 室温避光孵育20 min；加入1 ml 1×BD PharmLyse红细胞裂解液， 稍微涡旋， 37℃温箱避光孵育10 min裂解红细胞；500×g离心6 min；弃去上清， 加入1 ml 磷酸缓冲盐溶液（PBS）重悬细胞， 500×g离心5 min；弃去上清， 加入400 μl PBS重悬细胞。

1. 3. 2 T 细胞亚群检测 按照流式细胞仪C6（BD）操作手册开机， 调试仪器， NC对照圈取淋巴细胞群， 画门P1收集至少6000个细胞；实验管对比NC管圈取CD4（APC）阳性， SSC-APC CD4阳性门内15000个细胞。

1. 4 統计学方法 采用SPSS22.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数± 标准差（ x-±s）表示， 采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

与健康人比较， 晚期肺癌患者CD4+及CD4+/CD8+T细胞水平有所降低， 但差异无统计学意义（P>0.05）；晚期肺癌患者CD8+T细胞水平为（27.70±12.87）%， CD8+CD279+T细胞水平为（2.03±1.35）%较健康人的（22.67±5.88）%、（1.26±0.83）%显著升高， 差异有统计学意义（P<0.05）；晚期肺癌患者CD4+CD25+T细胞数量（2.01±1.26）%显著高于健康人（0.98±0.55）%， 差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

3 讨论

免疫系统利用复杂的正性及负性信号间的平衡保护机体免受外界干扰而预防自身免疫。这种平衡可被各种病理状态打破， 导致免疫系统抑制而发生肿瘤[5]。众所周知， 细胞免疫在机体抗肿瘤免疫中起着主导作用， T淋巴细胞亚群是人体内主要的细胞免疫系统， T淋巴细胞的数量与功能变化与肿瘤的发生、进展、扩散有一定的相关性[6]。本课题研究Tregs细胞与效应T细胞表面抑制性受体PD-1表达的相关性， 从而为今后靶向Tregs细胞的治疗奠定基础。本研究采用流式细胞术检测了30例晚期肺癌患者的T淋巴细胞亚群状态， 通过表1发现与健康人比较， 晚期肺癌患者CD4+及CD4+/CD8+水平有所降低， 但差异无统计学意义（P>0.05）， 可能与病例数较少有关；同时， CD8+水平升高， 说明肺癌患者细胞免疫功能处于抑制状态， 为病理形态的发生提供了免疫环境的条件。进一步证实上述基础研究的结论， 认为效应T细胞衰竭是抑制性Treg细胞募集到肿瘤原发部位， 使效应T细胞表面抑制性受体表达， 导致效应T细胞消耗、细胞免疫衰竭， 使肿瘤细胞免疫逃逸。因此， 为临床上去除Tregs或封闭其抑制功能可使肿瘤免疫恢复， 提供理论基础[7-9]。对肿瘤患者免疫功能状态的评估有助于判断肿瘤的发展及预后， 虽不能直接反映机体抗肿瘤免疫效应， 但对于动态观察肿瘤的生长转移及预后有一定参考价值[10]。必须强调， 转移性肺癌患者的免疫系统并不是一个惰性系统， 而是活跃的抑制系统。癌症免疫治疗必须克服负性调节机制， 目前最有效的免疫治疗方法是选择性地靶向限速环节。最近许多临床结果一致认为免疫抑制在肿瘤微环境中起关键性作用。因此逆转免疫抑制成为肿瘤免疫治疗的热点。

参考文献

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[2] Ribas A， Hamid O， Daud A， et al. Association of Pembrolizumab With Tumor Response and Survival Among Patients With Advanced Melanoma. Jama， 2016， 315（15）：1600.

[3] Herbst RS， Soria JC， Kowanetz M， et al. Predictive correlates of response to the anti-PD-L1 antibody MPDL3280A in cancer patients. Nature， 2014， 515（7528）：563.

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[5] 周莉， 任芳， 张冠男， 等. 非小细胞肺癌患者外周血CD8+T细胞表面PD-1的表达及其临床意义. 临床肿瘤学杂志， 2015（7）：625-628.

[6] 邢玉斐. 可溶性PD-L1在肺癌微环境中对T淋巴细胞功能影响及其在肺癌患者外周血中的表达特性. 苏州大学， 2012.

[7] 蒋琦. 调节性T细胞与晚期非小细胞肺癌患者预后的关系研究及相关文献Meta分析. 第二军医大学， 2015.

[8] 钱忠萍， 凌晨， 祁松楠， 等. 非小细胞肺癌围手术期患者外周血T细胞PD-L1/PD-1的检测及其意义. 临床检验杂志， 2015， 33（9）：695-697.

[9] 袁昕， 童建东， 汪竹， 等. 晚期肺癌患者化疗后外周血T细胞CD8^+CD28^-的表达及意义. 实用临床医药杂志， 2010， 14（17）：97.

[10] 胥萍， 陈慧， 陈永井， 等. 肺癌患者外周血中单个核细胞表面程序性死亡蛋白1及其受体的表达和生物学意义. 中华肿瘤杂志， 2013， 35（12）：910-913.

[收稿日期：2017-07-17]endprint