应用LC3B-PLA2研究Atg4B对LC3B的切割作用

洪甜，闫志风，张立，徐小洁，叶棋浓

1.军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100850；2.中国人民解放军总医院 妇产科，北京 100853；3.总参警卫局 卫生保健处，北京 100017

应用LC3B-PLA2研究Atg4B对LC3B的切割作用

洪甜1，闫志风2，张立3，徐小洁1，叶棋浓1

1.军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100850；2.中国人民解放军总医院 妇产科，北京 100853；3.总参警卫局 卫生保健处，北京 100017

目的：构建带Myc标签的LC3B-PLA2基因的真核表达质粒，获得LC3B-PLA2融合蛋白，并应用LC3B-PLA2研究Atg4B对LC3B的切割作用。方法：以本实验室保存的乳腺文库为模板，PCR扩增获得LC3B序列，与PLA2G10拼接后插入pCMV-Myc载体，用构建的重组质粒转染HEK293T细胞，Western印迹检测融合蛋白的表达，用LC3B-PLA2与Atg4B共转染的方法检测Atg4B对LC3B的切割作用。结果：菌液PCR、重组质粒双酶切及测序均表明重组质粒构建成功，Western印迹结果表明融合蛋白在HEK293T细胞中获得表达，LC3B-PLA2真核表达蛋白能够应用于Atg4B对LC3B切割作用的研究。结论：构建了pCMV-Myc-LC3B-PLA2真核表达质粒，LC3B-PLA2融合蛋白在Atg4B对LC3B切割作用的研究中至关重要，为进一步研究Atg4B在自噬过程中的作用奠定了基础。

LC3B-PLA2；Atg4B；自噬；重组质粒

自噬是进化上保守的，通过溶酶体依赖途径，分解多种蛋白质、大分子化合物和细胞器等，避免细胞积累未折叠蛋白和衰老细胞器，起着类似“管家”的功能。自噬还可以在营养不充足的条件下，维持细胞ATP的合成[1-3]。通过对酵母基因的分析，绝大多数自噬相关基因（autophagy-re⁃lated gene，ATG）已被确定。自噬失调能导致多种疾病，包括多种肿瘤和神经系统疾病，也与组织缺氧和细菌感染有关[4-6]。自噬发生时，pro-LC3B（酵母自噬相关蛋白Atg8的人同源体）被半胱氨酸酶Atg4B切割掉C端的5个氨基酸残基，形成激活形式的LC3B-Ⅰ，在自噬前体膜上，LC3B-Ⅰ进行PE修饰形成LC3-Ⅱ，Atg4B还可以使LC3-Ⅱ去酯化，使LC3B在自噬过程中得以重复利用[7-10]。尽管自噬研究越来越深入，但是对细胞中Atg4B活性的检测依然不够全面，Atg4B上游激活因子、下游抑制因子、转录后调控都有可能调节Atg4B的半胱氨酸酶活性，因此，亟待建立检测Atg4B活性的实验方法。在此，我们拟构建重组质粒pCMV-Myc-LC3B-PLA2，通过计算融合蛋白LC3B-PLA2的被切割程度，在细胞内检测Atg4B的半胱氨酸酶活性，为进一步研究Atg4B在自噬过程中的作用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

人胚肾HEK293T细胞由本室传代培养；质粒pCMV-Myc为本实验室保存；VigoFect转染试剂、Western印迹发光检测试剂盒购自威格拉斯生物技术有限公司；限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ、T4DNA连接酶、PCR相关试剂均购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自Promega公司；新生牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司；DMEM购自Gibco公司；胰酶购自Amersco公司；Flag-HRP、Myc-HRP和β-actin-HRP单克隆抗体购自Sigma公司；引物和 PLA2G10（43～165）片段由博迈德科技发展有限公司合成。

1.2 LC3B、PLA2引物设计及PCR条件

根据人LC3B的CDS序列和人PLA2G10（43～165）序列合成引物 1（5'-CGGAATTCGGATGCCG TCGGAGAAGACCTTCA-3'）、2（5'-CCTGCCAGTT CCAGGATCCCCACTGACAATTTCATCCCGA-3'）、3（5'-GGGATCCTGGAACTGGCAGGAACTGTGGGTT GTG-3'）、4（5'-ATAAGAATGCGGCCGCTCAGTCA CACTTGGGCGAGTCCGGCTCA-3'）。

以乳腺文库为模板，引物1和引物2为上下游引物扩增目的片段LC3B；以合成的人PLA2G10（43～165）为模板，引物3和引物4为上下游引物扩增目的片段PLA2G10（43～165），1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。以扩增产物LC3B和PLA2G10（43～165）为模板，引物1和引物4为上下游引物扩增目的片段 LC3B-PLA2G10（43～165）。扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s、62℃退火30s、72℃延伸30s，30个循环；72℃终延伸5min。用胶回收试剂盒回收扩增产物LC3BPLA2G10（43～165）（后文简写为 LC3B-PLA2）。

1.3 pCMV-Myc-LC3B-PLA2重组质粒的构建

分别用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切目的基因LC3B-PLA2和质粒载体pCMV-Myc，目的片段直接用胶回收试剂盒回收，酶切载体经1％琼脂糖凝胶电泳后胶回收大片段；用T4DNA连接酶连接具有相同粘性末端的目的基因和空载体，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，菌液PCR初步鉴定阳性克隆，提取质粒后经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切进一步鉴定目的基因是否导入质粒载体。

1.4 Western印迹检测重组质粒的真核表达

用含双抗和10％新生牛血清的DMEM培养基培养HEK293T细胞，当细胞密度达到80％～90％时，用VigoFect转染试剂将重组质粒pCMV-Myc-LC3B-PLA2和空载体pCMV-Myc分别瞬时转染人胚肾HEK293T细胞（细胞接种于6cm皿中，配置含 4μL VigoFect转染试剂的 200μL NaCl溶液，混匀，静置5min，再将含5μg重组质粒的200μL NaCl溶液与上述含 VigoFect的 200μL NaCl溶液混匀，静置15min，将混好的400μL溶液加入6cm皿中），转染后4～6h换新培养基，24h后收细胞；RIPA冰上裂解细胞30min，加等量的2×SDS上样缓冲缓，沸水煮15min，12 000r/min离心2min，取上清进行SDS-PAGE；电转至硝酸纤维素膜上后，5％脱脂牛奶封闭15min，Flag-HRP、β-actin-HRP抗体室温孵育1h，1×TBST洗膜5min×3次，用化学发光法显影。

1.5 Western印迹检测Atg4B对LC3B的切割作用

于6cm皿中培养HEK293T细胞，待细胞密度达80％～90％时进行转染，转染方法同上，转染24h后收集细胞。转染的质粒分别为pcDNA3.0-Flag和pCMV-Myc-LC3B-PLA2共转、pcDNA3.0-Flag-Atg4B和pCMV-Myc-LC3B-PLA2共转。用RIPA冰上裂解30min，加等量2×SDS上样缓冲液，Western印迹方法同上。

1.6 统计分析

用ImageJ软件对Western印迹结果进行灰度分析，数据计算使用公式：CleavedLC3B-PLA2=DLC3B/（DLC3B-PLA2+DLC3B+DPLA2）（D为光密度）。采用双尾t检验验证Atg4B活性实验的检测是否具有统计学意义，统计学分析采用GraphPad Prism 6软件，P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 pCMV-Myc-LC3B-PLA2重组质粒的鉴定

以本实验室保存的乳腺文库为模板，用引物1和2扩增获得约375bp的目的片段LC3B；以合成的PLA2G10（43～165）为模板，用引物3和4扩增获得约 372bp的目的片段PLA2G10（43～165）（图1）。以扩增得到的 LC3B 和 PLA2G10（43～165）为模板，用引物1和4扩增获得约747bp的目的片段 LC3B-PLA2G10（43～165）（图2）。将目的片段LC3B-PLA2G10（43～165）和载体质粒双酶切后连接转化大肠杆菌DH5α，挑菌落进行菌液PCR，PCR能扩增出近似747bp的菌落，初步认为是阳性菌落，挑阳性菌落提质粒后用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切鉴定，以空载体为阴性对照，结果显示，酶切的重组质粒切开为2条带，分别为空载pCMVMyc和目的基因LC3B-PLA2的大小（图3），并经测序证明重组质粒pCMV-Myc-LC3B-PLA2构建成功。

图1 LC3B、PLA2G10（43～165）产物电泳图

图2 LC3B-PLA2G10（43～165）产物电泳图

2.2 Western印迹检测LC3B-PLA2在HEK293T细胞中的表达

将构建的pCMV-Myc-LC3B-PLA2质粒转染HEK293T细胞，同时转染pCMV-Myc质粒为阴性对照，24h后提取蛋白进行Western印迹，检测LC3B-PLA2融合蛋白的表达，分别孵育Flag-HRP和β-actin-HRP抗体。结果显示，转染重组质粒后，在相对分子质量约32 000处出现目的条带LC3B-PLA2，证明重组质粒pCMV-Myc-LC3BPLA2获得表达（图4）。

2.3 Western印迹检测Atg4B对LC3B的切割作用

图3 重组质粒pCMV-Myc-LC3B-PLA2双酶切电泳图

图4 Western印迹检测LC3B-PLA2的表达

分别将质粒pcDNA3.0-Flag和pCMV-Myc-LC3B-PLA2、pcDNA3.0-Flag-Atg4B和pCMV-Myc-LC3B-PLA2共转HEK293T细胞，24h后收集细胞进行Western印迹，结果显示Atg4B和LC3B-PLA2均正确表达。统计分析表明，与对照pcDNA3.0-Flag相比，当Atg4B存在时，LC3B-PLA2被更多地切割成LC3B单体（图5）。

图5 Western印迹检测Atg4B对LC3B的切割

3 讨论

细胞通过自噬降解自身蛋白和细胞器来重新生成核苷酸、氨基酸、脂肪酸、单糖、ATP，以维持代谢的正常进行，使细胞抵抗饥饿[11-14]。研究表明：自噬能够防止组织损伤，维持基因组的稳定性；自噬能够促进乳腺癌的发生；KRAS诱导的肿瘤和BRAF诱导的肿瘤更易引发自噬；自噬控制肺癌的进程；自噬通过抑制p53的功能抑制肿瘤生长；自噬减弱细胞在生命活动中对谷氨酰胺的依赖；在p53缺失的KRAS诱导的肿瘤中，自噬维持脂质的动态平衡[15-17]。自噬可以通过抑制慢性组织损伤、炎症、基因组不稳定性，抑制肿瘤的起始，还可以在营养充足的情况下维持肿瘤细胞代谢和生长生存[18-20]。

目前，4种酵母Atg4人同源蛋白已被确立，即Atg4A、Atg4B、Atg4C和Atg4D。其中Atg4B对所有LC3蛋白都具有特异性，能够切割pro-LC3，去酯化LC3-PE；而Atg4B对LC3B的切割活性和去酯化活性最高，活性最强[21-23]。在Atg4B-/-小鼠实验中，无论在正常条件还是饥饿条件下，LC3的切割和去酯化都出现了显著障碍[24]。Reed等研究发现，当Atg4B的Ser383和Ser392位磷酸化异常时，Atg4B与酯化形式的LC3的相互作用减弱，从而表现出自噬异常[25]。Ellisen等发现，当Redd1高表达时，Atg4B活性下调，pro-LC3向LC3-Ⅰ的转化减少，自噬异常，导致有缺陷的线粒体大量积累，氧化磷酸化障碍，肌肉中ATP生成减少，运动能力下降[26]。

为了有效检测Atg4B对LC3B的切割活性，我们构建了pCMV-Myc-LC3B-PLA2真核表达质粒，在HEK293T细胞中获得表达；并且发现，当Atg4B表达时，LC3B-PLA2更多地被切割形成LC3B单体，证明LC3B-PLA2是有活性的，能够用于检测Atg4B的半胱氨酸酶活性。这为进一步研究Atg4B在自噬过程中的作用奠定了基础。

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LC3B-PLA2 for Measuring Cleavage Activity of Atg4B

HONG Tian1,YAN Zhi-Feng2,ZHANG Li3,XU Xiao-Jie1*,YE Qi-Nong1*
1.Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100850;2.Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853;3.Guard Bureau of Health Care,Beijing 100017;China
*Co-corresponding authors,YE Qi-Nong,E-mail:yeqn66@yahoo.com;XU Xiao-Jie,E-mail:miraclexxj@126.com

Objective:To construct recombinant eukaryotic expression plasmid of LC3B-PLA2 and measure activi⁃ty of Atg4B.Methods:The fragment of human LC3B gene was obtained from a human breast cDNA library by PCR and cloned into pCMV-Myc vector together with PLA2G10.For expression analysis,HEK293T cells were tran⁃siently transfected with pCMV-Myc-LC3B-PLA2 and analyzed by Western blot.For the activity of Atg4B analysis,HEK293T cells were transiently transfected with pcDNA3.0-Flag and pCMV-Myc-LC3B-PLA2,or pcDNA3.0-Flag-Atg4B and pCMV-Myc-LC3B-PLA2,and analyzed by Western blot.Results:pCMV-Myc-LC3B-PLA2 was veri⁃fied by PCR and double-enzyme cleavage.Western blot showed that the recombinant plasmid was successfully ex⁃pressed,and the recombinant protein can measure the activity of Atg4B.Conclusion:The recombinant eukaryotic expression plasmid pCMV-Myc-LC3B-PLA2 has been constructed,and it express protein which plays a critical role for measuring the activity of Atg4B,laying a foundation for the future study of the role of Atg4B in autopha⁃gy.

LC3B-PLA2;Atg4B;autophagy;recombinant plasmid

Q78

A

1009-0002（2017）04-0490-05

2016-12-29

国家自然科学基金（81672602，81472589，81502264）；北京市科技新星计划（Z141102001814055）；军事医学科学院创新基金转化医学项目（ZHYX003）

洪甜（1991- ），女，硕士研究生，（E-mail）htian1025@163.com

叶棋浓，（E-mail）yeqn66@yahoo.com；徐小洁，（E-mail）miraclexxj@126.com

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.016