稳定表达GFP-Parkin融合蛋白的SH-SY5Y细胞系的建立和功能初探

赵海洲，莫灿坤，林展乐，刘文华

肇庆学院 生命科学学院，广东 肇庆 526061

稳定表达GFP-Parkin融合蛋白的SH-SY5Y细胞系的建立和功能初探

赵海洲，莫灿坤，林展乐，刘文华

肇庆学院 生命科学学院，广东 肇庆 526061

目的：建立稳定表达GFP-Parkin的SH-SY5Y细胞系，并检测Parkin对MPP+引起的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用。方法：将Parkin编码序列克隆到载体pEGFP-C1中，构建重组质粒pEGFP-Parkin，转染SH-SY5Y细胞，通过G418筛选，建立稳定表达GFP-Parkin的SH-SY5Y细胞系；荧光显微镜和Western印迹鉴定Parkin表达，MTT法检测Parkin对MPP+致细胞损伤的保护作用。结果：酶切鉴定及测序结果表明重组质粒pEGFP-Parkin构建正确；荧光显微镜下可见细胞内有GFP-Parkin的融合表达，Western印迹检测发现相对分子质量79×103的蛋白条带；MTT结果显示Parkin能够减弱MPP+对SH-SY5Y细胞的损伤，与对照组相比，存活率高约15％，差异显著（P＜0.05）。结论：构建了稳定表达GFP-Parkin的SH-SY5Y细胞系，为进一步研究Parkin的细胞保护作用和其他功能机制奠定了基础。

Parkin蛋白；SH-SY5Y细胞；稳定表达；MPP+

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是第二大常见的神经退行性疾病，主要特征表现为静止性震颤、肌僵直、姿势异常及记忆力减退等。85％～90％的帕金森病患者呈散发性，其发病与农药、重金属等环境因素息息相关[1]。此外，帕金森病也存在家族遗传性，5％～15％的帕金森病患者由单基因家族遗传方式引起，这些基因包括Parkin（PARK2）、DJ-1（PARK7）、ATP13A2（PARK9）、PTEN-induced putative kinase 1（PINK1）、LRRK2（PARK8）和 SNCA（PARK1，4）等[2]。

Parkin基因于1998年被克隆，其突变呈现常染色体隐性遗传的青少年型帕金森病（autosomal recessive juvenile parkinsonism，ARJP）[3]。该基因定位于染色体6q25.2-27，位于遗传标记D6S305和D6S253之间，含12个外显子，基因的开放读框为1395bp，所编码的蛋白Parkin含465个氨基酸残基。Parkin基因的缺失和位点突变与ARJP相关[4-5]。Parkin是一种E3泛素连接酶，在上游基因PINK1的启动下，Parkin可以识别异常折叠蛋白，介导底物蛋白泛素化，进而通过泛素-蛋白酶体途径降解异常折叠蛋白[6]。Parkin还参与氧化应激及线粒体的自噬、形态维持和功能调控等[7-8]。过表达Parkin可以保护MPTP或6-OHDA引起的毒性损伤[9-10]。Parkin在神经和非神经组织中都有表达。在脑组织中，Parkin的亚细胞定位广泛，包括线粒体、高尔基体、突触小泡、内质网和细胞核等[11-13]；在培养的细胞中，Parkin的亚细胞定位还存在争议[14-15]。

转基因细胞模型是研究Parkin在细胞内的定位、功能，以及与其他蛋白相互作用的重要工具，已广泛用来研究Parkin与PD的关系[16-18]。以往在研究Parkin功能及其相关机制时常采用瞬时转染，但瞬时转染因存在转染效率低、外源基因低表达等问题，而不利于精确阐明Parkin在细胞中的定位、功能等。因此，建立稳定表达细胞系有利于深入研究其功能机制。

我们构建了稳定表达融合蛋白GFP-Parkin的SH-SY5Y细胞系，为深入研究Parkin的定位和其他功能机制提供了可靠的细胞模型。

1 材料和方法

1.1 材料

SH-SY5Y细胞购自中国典型培养物保藏中心（武汉）；胎牛血清、DMEM高糖培养基、胰蛋白酶、PBS为 Gibco公司产品；MTT、MPP+、G418为Sigma公司产品；BCA蛋白定量试剂盒、细胞裂解液购自碧云天公司；ECL发光液购自Tanon公司；抗体GFP来自Cell Signaling Technology公司，抗体actin、PRK8购自Santa Cruz Biotechnology公司；山羊抗兔二抗购自Merk Millipore公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自Omega公司；Lipo⁃fectAMINE 3000、蛋白marker、EB、EcoRⅠ和BamHⅠ来自Thermo Fisher Scientific公司；DNA marker购自广州东盛生物科技有限公司；其他试剂为国产分析纯产品。

1.2 Parkin基因的扩增

以pCMV-Tag2B-Parkin质粒（本实验室保存）为模板，引物1为5'-GCGCGAATTCTATGATAGT GTTTGTCAGGTTC-3'，引 物 2 为 5'-GCGCGGATC CCTACACGTCGAACCAGTGG-3'，分别添加酶切位点EcoRⅠ和BamHⅠ，PCR扩增出人源Parkin编码序列。

1.3 重组表达载体的构建及鉴定

上述PCR产物经10g/L琼脂糖凝胶分离，用胶回收试剂盒对目的片段切胶回收，将PCR胶回收产物和pEGFP-C1质粒分别用限制性内切酶EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切，用T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α感受态，卡那霉素筛选并挑取阳性单克隆菌落，菌落于37℃培养过夜，用质粒提取试剂盒提取重组质粒，经EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切初步鉴定，DNA测序进一步确认。测序鉴定采用通用引物，上游引物为EGFP-Cfor（5'-AG CACCCAGTCCGCCCTGAGC-3'），下 游 引 物 为SV40-pArev（5'-GAAATTTGTGATGCTATTGC-3'）。

1.4 细胞培养

SH-SY5Y细胞用含10％胎牛血清的无抗生素DMEM培养基，在恒温37℃、含5％CO2的细胞培养箱中培养，每隔2～3d细胞传代一次，用对数期细胞进行实验。

1.5 稳定表达GFP-Parkin细胞系的建立

转染前将SH-SY5Y细胞接种于6孔板中，细胞密度为1×105/孔，待细胞生长至70％～80％融合度，用 LipofectAMINE 3000转染 pEGFP-Parkin，同时设未转染和转染载体pEGFP-C1的对照。转染方法参照试剂盒说明书。转染后48h，将细胞培养液更换为含600μg/mL G418的DMEM培养基，筛选阳性克隆，之后每隔3d更换一次培养基（含600μg/mL G418）。

转染3周后，对表达绿色荧光的阳性细胞用含300μg/mL G418的DMEM培养基维持培养。每天在荧光显微镜下观察细胞，阳性细胞用于后续实验，部分细胞冻存备用。

1.6 细胞形态学观察

对挑选的阳性细胞每天用荧光倒置显微镜观察并拍照，观察内容包括细胞生长的快慢、突触生长、细胞贴壁、细胞形态变化，以及细胞内的荧光强度等。

1.7 MTT法检测细胞存活率

SH-SY5Y细胞按1×104/孔接种于96孔培养板，铺板后24h用于实验。实验设立空白组（只有培养基，无细胞）、对照组（不加药物）和药物组（1mmol/L MPP+处理）。实验每组设3个复孔，药物作用 48h后每孔加入200μL MTT（0.5 mg/mL），孵育4h，弃上清，加入150μL DMSO溶解甲瓒，用酶标仪测定D490nm值。细胞存活率（％）=（药物组D490nm-空白组D490nm）/（对照组D490nm-空白组D490nm）×100％。实验重复3次。

1.8 Western印迹检测Parkin的表达

用6cm培养皿传代培养细胞，待细胞达到90％～100％融合度，用PBS洗1次，将细胞刮下，12 000r/min离心1min，弃上清，加入细胞裂解液至细胞沉淀，冰上裂解细胞20min，15 000r/min离心10min后取上清。Western印迹检测Par⁃kin、actin的表达，分离胶浓度10％，电泳后转膜，加相应的一抗（GFP、Parkin和actin）、二抗孵育，ECL法显影，化学发光成像系统拍照。

1.9 统计学分析

实验结果数据分析采用SPSS 22.0软件进行，数据以x±s表示，采用单因素方差分析（ANOVA）和t检验，P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 重组质粒的构建与鉴定

如图1A所示，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，可以看到1.4kb左右的条带（白色箭头所示），与预期大小相符。

本研究所构建的pEGFP-Parkin重组质粒是将人源Parkin编码序列通过EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切位点插入pEGFP-C1载体。重组质粒EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切结果如图1B所示，可见1.4kb（目的基因大小）和4.7kb（载体大小）2条片段，与预测结果相符，表明质粒构建成功。进一步DNA测序结果也显示Parkin基因成功构建于pEGFP-C1载体上，与GenBank登录序列（AB009973）进行序列比对，序列完全一致（序列未示）。

2.2 荧光显微镜检测GFP-Parkin的表达

用质粒pEGFP-C1和pEGFP-Parkin转染SHSY5Y细胞，经G418选择性培养。用荧光显微镜检测稳定表达载体质粒pEGFP-C1的细胞（命名为SH/GFP）和稳定表达pEGFP-Parkin的细胞（命名为SH/GFP-Parkin）的荧光情况。结果显示（图2），SH/GFP和SH/GFP-Parkin细胞都可以稳定表达绿色荧光（图2D和F），可用于后续实验。

2.3 Western印迹检测GFP-Parkin的表达

图1 Parkin基因扩增和重组质粒鉴定

分别用GFP抗体和PRK8抗体对蛋白进行检测。GFP抗体检测显示（图3A），稳定转染载体质粒pEGFP-C1的SH/GFP细胞可见相对分子质量约27×103的GFP条带；稳定转染pEGFP-Parkin的SH/GFP-Parkin细胞有相对分子质量约79×103的蛋白条带，与GFP-Parkin的预测相对分子质量相符。PRK8抗体检测也发现，SH/GFP-Parkin细胞可见79×103的 GFP-Parkin融合蛋白（图3B）。这表明在蛋白水平上，Parkin基因在SH/GFP-Parkin细胞中稳定表达。

2.4 Parkin对MPP+损伤的保护作用

MTT实验结果（图4A）表明，经1mmol/L MPP+处理 48h，载体组细胞（SH/GFP）存活率为（43.9±3.9）％，稳定表达 Parkin组细胞（SH/GFPParkin）存活率为（58.9±8.4）％，Parkin稳定表达组细胞比载体组细胞存活率高约15％，差异显著（P＜0.05）。这表明Parkin可以部分抑制 MPP+对SH-SY5Y的损伤。

图4B显示，不经MPP+处理的正常细胞呈梭形，而SH/GFP细胞经1mmol/L MPP+作用48h后，较多细胞皱缩变圆；SH/GFP-Parkin细胞经1mmol/L MPP+作用48h后，较少细胞变圆。该结果与MTT实验结果相符。

图2 荧光检测GFP-Parkin蛋白的稳定表达

图3 Western印迹检测GFP-Parkin的表达

3 讨论

Parkin蛋白的确切功能尚不明确，但已知其是一个E3泛素蛋白连接酶[19]。E3泛素蛋白连接酶是蛋白酶体降解系统的组成部分，主要功能是降解细胞内不需要的或错误折叠的蛋白质。

图4 Parkin对MPP+损伤的保护作用

Parkin基因缺失和突变是ARJP发病的原因之一。Parkin保护多巴胺能细胞的机制并不十分清楚，目前一般认为Parkin通过对特定底物的降解来清除胞内异常折叠蛋白，对细胞起到保护作用[6]。Parkin具有多种多样的重要功能。如可维持线粒体的完整性，调节线粒体的自噬过程[7]；还可抑制内质网应激和自由基伤害导致的细胞死亡等[20]。另有研究显示Parkin突变和黑色素瘤之间存在相关性[21]。Parkin过表达及Parkin转基因动物显示其对神经毒素MPTP和6-OHDA引起的多巴胺神经元损失，以及α-synuclein、A-beta对神经元的毒性具有明显的保护作用[9-10,22-23]。本研究也发现稳定过表达Parkin可以保护MPP+对SHSY5Y细胞的毒性损伤。但Parkin可能还有更多功能未被发现。对Parkin进行深入研究，阐明其和PD病理之间的关系，将有助于提供新的药物作用靶点，为PD的治疗提供新的策略。

目前，对Parkin的研究主要采用瞬时转染方式[17,24-25]。虽然瞬时转染较为简单，但成本高，需要大量质粒和转染试剂，转染效率偏低，并且基因表达不稳定，表达时间有限，不利于重复实验和实验结果比较。所以建立稳定表达Parkin蛋白的细胞系就显得尤为重要，特别是在转染效率较低的SH-SY5Y细胞中。

目的蛋白与绿色荧光蛋白的融合表达具有检测方便、不须染色、对细胞无毒、利于研究目的蛋白的细胞内定位等优点[26]。目前Parkin在细胞内的亚细胞定位还存在争议。

本研究构建了稳定表达融合蛋白GFP-Parkin的细胞系，这将有利于对Parkin细胞内亚细胞定位的进一步研究，尤其有利于蛋白在活细胞中的实时定位研究。目前已建立了稳定表达Parkin的PC12和SH-SY5Y细胞系[27-28]，但其中Parkin并未融合GFP，不利于Parkin亚细胞定位的研究。而本研究构建的GFP-Parkin细胞系可实现对Parkin的可视化研究，这为今后观察Parkin蛋白活细胞实时定位、细胞内的分布和转运提供了理想的细胞系。

尽管对Parkin蛋白的研究已进行多年，但由于其功能多样，因此很多功能机制尚不清楚，目前还处于初级阶段。本研究建立了一个在基因组DNA中稳定整合pEGFP-Parkin的SH-SY5Y细胞系，在该细胞系中融合蛋白GFP-Parkin得到有效稳定表达，并初步证明Parkin可以减弱MPP+对SH-SY5Y细胞的损伤。该细胞系的建立为深入研究Parkin基因功能提供了较好的细胞模型。

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EstablishmentofSH-SY5Y CellLineStablyExpressing GFP-Parkin and its Preliminary Function

ZHAO Hai-Zhou,MO Can-Kun,LIN Zhan-Le,LIU Wen-Hua*
School of Life Sciences,Zhaoqing University,Zhaoqing 526061,China
*Corresponding anthor,E-mail:wenhualiu@hotmail.com

Objective:To establish SH-SY5Y cell line stably expressing GFP-Parkin,and evaluate its protective effect against MPP+by MTT assay.Methods:The coding sequence of human Parkin was cloned into the vector pEGFP-C1 to construct recombinant plasmid pEGFP-Parkin.The pEGFP-Parkin plasmid was transfected into SHSY5Y cells using LipofectAMINE 3000,and positive-expression cells were screened by using G418.The expres⁃sion of GFP-Parkin was identified with fluorescent microscopy and Western blot.The protective effect of Parkin against MPP+in SH-SY5Y cells was detected by MTT assay.Results:The constructed pEGFP-Parkin plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion and DNA sequencing analysis.Fluorescence photographs and West⁃ern blot data revealed that the SH-SY5Y cells expressed GFP-Parkin protein stably.MTT assay showed that sur⁃vival of Parkin group was 15％higher than that of control group after exposure to 1mmol/L MPP+for 48h（P＜0.05）,indicating that Parkin significantly enhanced cell survival.Conclusion:SH-SY5Y cell line stably express⁃ing GFP-Parkin has been established,laying a foundation for further investigating cytoprotective effects and other functional mechanisms of Parkin.

Parkin protein;SH-SY5Y cells;stable expression;MPP+

Q78;R741.02

A

1009-0002（2017）04-0429-06

2017-04-17

国家自然科学基金（31271124）；广东省教育厅重大项目（2014KZDXM075）；广东省教育厅创新团队项目（2015KCXTD032）；广东省教育厅青年创新人才项目（2016KQNCX178）

赵海洲（1987- ），男，硕士，研究实习员，（E-mail）zhaohaizhou012@163.com

刘文华，（E-mail）wenhualiu@hotmail.com

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.005