组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A对肿瘤多药耐药细胞敏感性的影响

周晓平，赵璐，李丹妮，邹鹏

沈阳医学院，辽宁 沈阳 110016

组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A对肿瘤多药耐药细胞敏感性的影响

周晓平，赵璐，李丹妮，邹鹏

沈阳医学院，辽宁 沈阳 110016

目的：探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A（TSA）对肿瘤多药耐药细胞敏感性的影响。方法：采用MTT法观察TSA对敏感细胞MCF7和多药耐药细胞MCF7/DOX存活率的影响；采用琼脂糖凝胶电泳、Western印迹和实时荧光定量PCR观察DNA梯带形成和凋亡相关蛋白的表达以及乙酰化H3和H4的表达。结果：TSA浓度为20～200 nmol/L时，MCF7组细胞存活率均显著高于MCF7/DOX组，当TSA浓度为50和100 nmol/L时差异最为显著；琼脂糖凝胶电泳表明，TSA浓度为50和100 nmol/L时，与MCF7组相比，MCF7/DOX组产生了更显著的DNA梯带，同时caspase-6及凋亡标志蛋白PARP表达水平高于MCF7组；2株细胞中乙酰化H4和H3没有显著差别，实时荧光定量PCR检测得到相同结果。结论：组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA通过激活caspase-6促进多药耐药细胞MCF7/DOX凋亡而抑制其增殖，与MCF7相比，TSA对MCF7/DOX细胞更为敏感，但原因并非H3、H4乙酰化的差异表达。TSA具有克服肿瘤细胞多药耐药性的应用前景。

组蛋白去乙酰化酶；曲古抑菌素A；肿瘤多药耐药细胞

肿瘤细胞的多药耐药性（multidrug resis⁃tance，MDR）是指肿瘤细胞对某种化疗药物产生耐药性，对其他结构上无关、作用机理各异的化疗药物也产生交叉耐药性，这是临床肿瘤化疗失败的主要原因。其机制主要有：细胞膜上外排抗肿瘤药物蛋白（如P-糖蛋白）的超表达、解毒酶系（如谷胱甘肽转移酶π）活性改变以及细胞凋亡途径改变增强等[1]。

组蛋白去乙酰化酶（histonedeacetylase，HDAC）是一类维持染色体基本组成单位核小体中组蛋白乙酰化平衡的关键蛋白酶之一。研究表明，在肿瘤发生发展和转移过程中，HDAC表达上调，组蛋白末端的赖氨酸残基去乙酰化作用失衡，导致癌基因转录表达，细胞周期、细胞增殖和细胞凋亡改变等生理过程[2]。研究发现，HDAC抑制剂可作为体内外抗肿瘤和多重抗肿瘤的重要靶点。现阶段HDAC抑制剂主要有氧肟酸类、异羟肟酸类、环状四肽类、脂肪酸盐类、苯甲酰胺类和亲电酮类化合物等[3-4]。

曲古抑菌素A（trichostatin A，TSA）属于氧肟酸类，是一种强效、特异而可逆的HDAC抑制剂，可以抑制多种肿瘤细胞生长，诱导细胞周期阻滞及细胞凋亡。研究显示，在乳腺癌细胞中，TSA和丁酸钠可相互作用，调节能量代谢，参与肿瘤细胞的转移侵袭[5]。Liu等发现TSA和他莫昔芬联合作用miR-204和雌激素受体α激活AKT/mTOR信号通路，抑制乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231的生长[6]。据报道，HDAC造成组蛋白乙酰化状态的失衡与多药耐药性的形成关系密切[7]。因此，我们探讨了TSA对肿瘤多药耐药细胞的作用，冀望其成为克服肿瘤细胞多药耐药性的前景药物。

1 材料与方法

1.1 材料

人乳腺癌耐多柔比星的MCF7/DOX多药耐药细胞及其亲本MCF7敏感细胞来自美国国立癌症研究院（NCI）；TSA、青链霉素双抗、二甲基亚砜（DMSO）、胰蛋白酶购自Sigma公司；DMEM培养基粉末、胎牛血清（FBS）购自Gibco公司；细胞全蛋白提取试剂盒购自凯基生物公司；BCA蛋白定量试剂、ECL发光剂和兔抗Actin购自碧云天生物科技有限公司；兔抗PARP抗体，兔抗切割cas⁃pase-6抗体，抗乙酰化H3、H4和组蛋白H3购自Cell Signaling Technology公司；SuperScriptⅢ试剂盒购自Invitrogen公司。

CO2培养箱（Thermo Forma SeriesⅡ）；倒置显微镜XSZ-DZ（重庆光学仪器厂）；电热恒温水箱（中国恒科公司）；超净工作台（北京半导体设备厂）；液氮运输储存罐（东亚机电工贸有限公司）；电泳、转膜设备和琼脂糖凝胶电泳仪（BioRad公司）；显影机（日本柯达公司）。

1.2 细胞培养及分组

人乳腺癌多药耐药细胞MCF7/DOX及其亲本MCF7细胞用含 10％FBS的DMEM，于37℃、5％CO2培养箱中培养，待细胞进入对数生长期进行实验。

1.3 MTT法

取对数生长期细胞，用不同浓度的TSA处理72h；测定前每孔加入5 mg/mL MTT 20μL，37℃孵育4h后小心吸除培养液，每孔加入200μL DMSO，混匀后用酶标仪测定D570nm值；将各测试孔的D570nm值减去本底D570nm值（完全培养基加MTT，无细胞），计算细胞存活率[细胞存活率（％）＝（加药细胞 D570nm-本底 D570nm）/（对照细胞D570nm-本底D570nm）×100％]。每检测点取3个平行孔的平均值，绘制细胞存活率曲线。

1.4 细胞基因组DNA的提取和琼脂糖凝胶电泳

取对数生长期细胞，用药物处理细胞到指定时间，预冷PBS洗1次，加入1mL PBS后用细胞刮刀将细胞全部刮下，12 000r/min离心20s；弃上清，加入100μL 含 100μg/mL RNA 酶的裂解液（10mmol/L Tris/HCl，pH8.0，100mmol/L NaCl，25mmol/L EDTA，0.5％SDS），37℃温育 30min；再加入100μL含蛋白酶K的裂解液，使其终浓度为 200μg/mL，50℃温育 150min；用 200μL 的Tris饱和酚∶氯仿∶异戊醇抽提3次，吸取所需上清；用2倍体积的冰冷无水乙醇/0.3 mol/L乙酸钠沉淀，振荡混匀，-20℃放置1h或过夜；12 000r/min离心15min，弃上清；用75％冷乙醇洗1次，12 000r/min 离心 2min，弃上清；用 30μL TE（pH8.0）溶解DNA沉淀，紫外分光光度计测定DNA浓度；1.2％琼脂糖凝胶电泳分离DNA，80 V电泳1h，胶置于EB染色液（终浓度为1μg/mL）中染色20min，在紫外投射仪下观察电泳条带，凝胶成像系统照相。

1.5 Western印迹检测蛋白表达

取对数生长期细胞，用药物处理细胞到指定时间，4℃、500r/min离心3min收集细胞，用PBS洗涤2次，用细胞全蛋白提取试剂盒提取全蛋白，并以Bradford法测浓度后于-70℃保存备用；用15％SDS-PAGE 分离 40μg全蛋白,电转至 NC膜，用TBST配置5％的脱脂奶粉封闭1h；加入1∶2000稀释的抗-PARP、caspase-6、乙酰化H3、乙酰化H4和组蛋白H3，4℃孵育过夜，然后取出NC膜，TBST室温洗3次，每次5min；加入二抗，室温孵育1h，洗膜3次，每次5min；在暗室里按照1∶1的比例混合发光底物A、B液，取出膜放入Bio-Rad显像仪，保存图片，并采用Quantity One分析软件对图像灰度进行分析。

1.6 实时荧光定量RT-PCR检测细胞H3、H4基因表达

培养2株细胞至对数生长期，4℃、500r/min离心3min，收集细胞，用TRizol试剂抽提总RNA，用SuperScriptⅢ试剂盒合成第一链cDNA，以合成的cDNA为模板进行实时荧光定量PCR（表1）。

表1 实时荧光定量PCR中的引物序列

1.7 统计学处理

采用SPSS19.0统计学软件包进行数据处理，采用独立样本t检验分析2组之间的差异。

2 结果

2.1 TSA对MCF7和MCF7/DOX细胞存活率的影响

采用MTT法检测TSA对MCF7和MCF7/DOX细胞存活率的影响，结果见图1。TSA浓度为20～200 nmol/L时，MCF7组细胞存活率均显著高于MCF7/DOX组，且在TSA浓度为50和100 nmol/L时，MCF7组细胞存活率分别为0.95、0.55，而多药耐药细胞MCF7/DOX组细胞存活率仅为0.65、0.4，相差最为显著（P＜0.05）。这表明TSA 对多药耐药细胞MCF7/DOX更加敏感。

2.2 TSA对MCF7和MCF7/DOX细胞凋亡的影响

在细胞凋亡末期，DNA会发生特征性的核小体间断裂，产生180～200bp整数倍DNA梯带，用琼脂糖凝胶电泳可以判断凋亡的发生。凋亡指标DNA ladder的1.2％琼脂糖凝胶电泳结果显示（图2），当TSA浓度为50、100 nmol/L时，与MCF7组相比，MCF7/DOX组产生了更为显著的DNA梯带。这表明与MCF7组相比，TSA诱导多药耐药MCF7/DOX细胞凋亡的现象更为显著，且在TSA浓度为50 nmol/L时，MCF7/DOX细胞即出现凋亡，说明TSA对MCF7/DOX细胞更为敏感。

图1 TSA对MCF7和MCF7/DOX细胞生存率的影响

2.3 Western印迹检测TSA对MCF7和MCF7/DOX细胞凋亡相关蛋白的影响

分别用0、50和100 nmol/L TSA处理MCF7和MCF7/DOX组细胞24h，提取全蛋白，检测凋亡标志蛋白PARP及caspase-6的变化，结果如图3。当TSA浓度为100 nmol/L时，MCF7组有caspase-6和凋亡标志蛋白PARP的表达；而MCF7/DOX组在TSA浓度为50 nmol/L时即有这2种蛋白的表达，且表达量显著高于MCF7组。提示与MCF7细胞相比，TSA更能激活MCF7/DOX细胞中caspase凋亡通路，且TSA对MCF7/DOX细胞更为敏感。

2.4 Western印迹、实时荧光定量RT-PCR检测MCF7和MCF7/DOX细胞H3、H4乙酰化状态及基因表达情况

培养敏感细胞MCF7和多药耐药细胞MCF7/DOX至对数生长期，分别提取2株细胞的全蛋白和基因，检测H4和H3乙酰化状态及基因表达量。结果如图4、5，2株细胞中乙酰化H4和H3的蛋白和基因表达量无显著差别（P＞0.05）。提示总体组蛋白的乙酰化及基因表达在2株细胞内没有显著差异，这是一个阴性结果。

3 讨论

近年来，研究表明HDAC家族成员的表达和活性在多种肿瘤中通常有上调的表现，可导致肿瘤细胞增殖和侵袭转移、新生血管的生成、抑制肿瘤细胞凋亡等生理活动，提示HDAC与肿瘤的发生发展密切相关。随着HDAC与肿瘤作用机制的阐明，越来越多的HDAC抑制剂的潜在抗肿瘤活性成为抗肿瘤药物研究的热点。TSA是经典的HDAC抑制剂，其抗肿瘤作用已有初步研究[7-8]。在肿瘤治疗中，肿瘤多药耐药性是其免受化疗药攻击的最重要的防御机制，其原因可能是药物在肿瘤细胞内聚集减少、药物解毒代谢加快和DNA损伤修复等。有报道显示HDAC与多药耐药性的形成关系密切，但TSA是否对肿瘤多药耐药细胞起作用还未见相关报道。

我们采用MTT法检测了TSA对MCF7和MCF7/DOX细胞存活率的影响，结果显示TSA对多药耐药细胞MCF7/DOX更加敏感，提示TSA具有克服肿瘤细胞多药耐药性的应用前景。为了进一步解释TSA通过何种方式调节细胞存活，我们采用琼脂糖凝胶电泳方法检测，发现TSA诱导多药耐药MCF7/DOX细胞凋亡的现象更为显著，且对MCF7/DOX细胞更敏感，同时说明TSA通过促进凋亡调节细胞存活率。

图2 TSA对MCF7和MCF7/DOX细胞凋亡产生的DNA梯带

图3 Western印迹检测TSA对MCF7和MCF7/DOX细胞凋亡相关蛋白的影响

图4 Western印迹检测MCF7和MCF7/DOX细胞乙酰化H3、H4蛋白的表达

图5 实时荧光定量RT-PCR检测MCF7和MCF7/DOX细胞H3、H4基因的表达

抗肿瘤药物发挥其活性的重要方式之一是诱导肿瘤细胞凋亡。细胞凋亡的途径有2条，即死亡受体通路和线粒体通路。这2条途径都以各自的方式激活caspase级联反应。因此，caspase凋亡通路的激活是判断细胞凋亡的分子学标志和凋亡发生的重要机制。为了进一步研究TSA是否涉及caspase凋亡通路的激活来调节细胞存活率，我们采用Western印迹检测了不同浓度的TSA作用MCF7和MCF7/DOX细胞24h后caspase-6及凋亡标志蛋白PARP的变化。结果提示，TSA通过激活caspase凋亡通路调节2株细胞的存活率，且在MCF7/DOX细胞中，当TSA浓度为50 nmol/L时就出现PARP切割片段和caspase-6切割片段，而MCF7组则无。提示TSA对MCF7/DOX细胞更敏感。

2株细胞的总体组蛋白的乙酰化及表达没有显著差异，这是一个阴性结果。但是不能排除组蛋白某特定位置赖氨酸的乙酰化会不同；同时，也不能排除个别蛋白（如一些非组蛋白，也是HDAC的底物）的乙酰化在2种细胞内会各异，也许正是这些蛋白的乙酰化不同导致TSA对多药耐药细胞更敏感。

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Study of Histone Deacetylase Inhibitor Trichostatin A on the Sensitivity of Multidrug Resistance Cells

ZHOU Xiao-Ping,ZHAO Lu,LI Dan-Ni*,ZOU Peng*
Shenyang Medical College,Shenyang 110016,China
*Co-corresponding authors,ZOU Peng,E-mail:zouroc@hotmail.com;LI Dan-Ni,E-mail:aqualdn@163.com

Objective:To investigate the effect and molecular mechanism of histone deacetylase inhibitor tricho⁃statin A（TSA） on the sensitivity of multidrug resistance cells.Methods:The cell viability of MCF7 and human breast cancer doxorubicin-resistant MCF7/DOX cells were tested by MTT.The DNA ladder,apoptosis protein ex⁃pression and acetylation H3 and H4 expression were tested by agarose gel electrophoresis,Western blot and realtime fluorescence quantitative PCR.Results:The cell survival rate of MCF7/DOX group was significantly higher than that in the MCF7 group under 20～200 nmol/L TSA,especially 50 and 100 nmol/L TSA.Compared to MCF7 group,the DNA ladder was significantly increased under the 50 and 100 nmol/L TSA.When the concentration of TSA was 50 and 100 nmol/L TSA,the protein expression level of caspase-6 and PARP elevated more significant⁃ly in the MCF7/DOX group than that in the MCF7 group.The expression level of H4 and H3 acetylation had no significantly difference.Conclusion:Histone deacetylase inhibitorTSA inhibited cellviability ofMCF7/DOX through activation of caspase-6.Compared with MCF7,TSA is sensitive to MCF7/DOX,but the reason for whichis not the different expression of H3,H4 acetylation.TSA has the potential to be applied in the treatment of multi drug resistance.

histone deacetylase;trichostatin A;oxorubicin-resistant

Q25

A

1009-0002（2017）04-0460-05

沈阳医学院优秀人才启动基金（20103053）

周晓平（1987- ），女，硕士研究生，（E-mail）zhaolu1035931278@163.com

邹鹏，（E-mail）zouroc@hotmail.com；李丹妮，（E-mail）aqualdn@163.com

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.011