白介素-8对SKOV3细胞系卵巢癌干样细胞特性的影响

杨剑锋，许 畅，宁映霞，邓宇傲，李 翔，李 程，陈 阿，崔迎红

（1. 湖南师范大学医学院，长沙 410013；2. 广州医科大学附属第一医院，广州 510120；3. 深圳市人民医院妇产科，深圳 518020）

白介素-8对SKOV3细胞系卵巢癌干样细胞特性的影响

杨剑锋1，许 畅1，宁映霞2，邓宇傲3，李 翔1，李 程1，陈 阿1，崔迎红1

（1. 湖南师范大学医学院，长沙 410013；2. 广州医科大学附属第一医院，广州 510120；3. 深圳市人民医院妇产科，深圳 518020）

目的：研究白介素-8（IL-8）能否促成人卵巢癌SKOV3细胞系细胞肿瘤干细胞样细胞特性。方法：用添加或未添加重组人IL-8（rhIL-8：10.0 ng/mL）的干细胞条件培养基处理SKOV3细胞。肿瘤球形成和琼脂集落形成试验测定球形成率和集落形成率。蛋白质印迹分析肿瘤干细胞标志蛋白CD133和CD44表达水平。结果：rhIL-8（10.0 ng/mL）显著地增高SKOV3细胞肿瘤球形成率和琼脂集落形成率。此外，rhIL-8（10.0 ng/mL）上调SKOV3细胞CD133和CD44蛋白表达。结论：rhIL-8具有促进SKOV3细胞肿瘤干细胞样细胞特性作用。

卵巢癌；肿瘤干细胞；白介素-8；自我更新；CD133；CD44

肿瘤生物学领域的新理论推定具有干细胞样性质的细胞亚群，亦称为肿瘤干样细胞（Cancer stem-like cells，CSLCs）驱使肿瘤发生和演进［1］。我们先前的实验结果证实SKOV3细胞系球细胞具有CSLCs性质［2，3］。有研究提示白介素-8（IL-8）触发STAT3信号传导活化与卵巢癌致瘤潜能和多药耐药关联［4，5］。特别重要的是大量研究结果证实IL-8参与肿瘤微环境与肿瘤干细胞交互作用，并能有效促成肿瘤干细胞特性［6-8］。本文的研究目的在于检查和确定IL-8与人卵巢癌SKOV3细胞系细胞CSLCs特性的直接联系。

1 材料与方法

1.1 试剂与细胞培养 重组人表皮生长因子（EGF，Invitrogen公司，Carlsbad，CA，USA）、重组成纤维细胞生长因子（bFGF，Invitrogen公司）、不含维生素A的B27添加物（Invitrogen公司）、牛血清白蛋白（BSA，Sigma-Aldrich公司）、胰岛素（Sigma-Aldrich公司）、Accutase细胞分离溶液（德国PromoCell公司，）、DMEM/F12培养基（GIBCO公司，500mL/瓶，保存于2～8℃）、鼠抗人β-actin单克隆抗体源自美国Santa Cruz Biotechnology，Inc.公司（dilution，1：2000；cat. no. sc-7210；Santa Cruz Biotechnology，Inc. Dallas，TX，USA）；兔抗人CD133多克隆抗体源自美国Abcam，Inc. 公司（dilution，1：2000；no.ab66141；Abcam，Inc.Burlingame，CA，USA）；兔抗人CD44多克隆抗体源自美国Abcam，Inc. 公司（dilution，1：2000；no.ab41478；Abcam，Inc.Burlingame，CA，USA）；辣根过氧化酶标记兔抗鼠Ig G二抗源自中国碧云天生物技术研究所（dilution，1：2000；cat. no. A0216；Beyotime Institute of Biotechnology，中国上海市）；辣根过氧化酶标记山羊抗兔Ig G二抗源自中国碧云天生物技术研究所（dilution，1：2000；cat. no. A0239；Beyotime Institute of Biotechnology，中国上海市）；增强化学发光检测试剂购美国Amersham Pharmacia Biotech公司（Piscataway，NJ，USA）。

人卵巢癌SKOV3细胞系细胞购自中国科学院细胞中心（中国上海市）。参照文献［2，3］描述的方法和步骤，维持细胞生长和进行球细胞培养。

1.2 球形成率测定 细胞用添加或未添加rhIL-8（10.0 ng/mL）的无血清干细胞条件培养基悬浮细胞，以2000个/mL的密度每孔0.5 mL接种于24孔超低粘附培养板，培养6天，计数每孔肿瘤球数。球形成率计算公式：球形成率（%）=每孔球均数/接种活细胞总数（1000个细胞）×100%。

1.3 琼脂集落形成率测定 取35mm直径细胞培养皿，用含0.8% 琼脂糖的20% FBS（GIBCO公司）DMEM/F12培养基每皿1.0 mL预先包被皿底，然后，配制含0.4% 琼脂糖和 1000 个细胞以及 rhIL-8（10.0 ng/mL）添加或未添加rhIL-8（10.0 ng/mL）的无血清干细胞条件培养基的上层培养体系，每皿1.0 mL接种底层0.8%琼脂糖之上。培养14天，计数每孔集落数。集落形成率计算公式：集落形成率（%）=每皿集落均数/接种活细胞总数（1000个细胞）×100%。

1.4 蛋白质印迹 参照先前发表文献［2，3］的方法和步骤完成蛋白质印迹分析。

1.5 统计学分析 各组实验数据录入Spss 20.0 for windows evaluation 软件建立数据库，用均数±标准差（±SD）表示，采用One Way ANOVA方差分析；首先进行方差齐性检验，在方差齐性情况下，多组均数间比较采用LSD法，在方差不齐情况下，多组均数间比较采用Tukey's检验。P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 IL-8增强卵巢癌SKOV3细胞系自我更新能力

图1显示：与干细胞条件培养基培养的SKOV3细胞比较，添加rhIL-8（10.0 ng/mL）干细胞条件培养基培养的SKOV3细胞球形成率增高（P＜0.05）。

2.2 IL-8促进卵巢癌SKOV3细胞琼脂集落形成能力

图2可见：与干细胞条件培养基培养的SKOV3细胞比较，添加rhIL-8（10.0 ng/mL）干细胞条件培养基培养的SKOV3细胞琼脂集落形成能力增强（P＜0.05）。

2.3 IL-8上调卵巢癌SKOV3细胞CD133蛋白表达

图3表明：与干细胞条件培养基培养的SKOV3细胞比较，添加rhIL-8（10.0 ng/mL）干细胞条件培养基培养的SKOV3细胞CD133蛋白表达明显上调（P＜0.05）。

图1 IL-8对SKOV3细胞系肿瘤球形成能力的影响（Mean±SD，n=3）*P＜0.05，vs.干细胞条件培养基培养的SKOV3细胞。

图2 IL-8对SKOV3细胞系琼脂集落形成能力的影响（Mean±SD，n=3）*P＜0.05，vs.干细胞条件培养基培养的SKOV3细胞。

图3 IL-8对SKOV3细胞CD133蛋白表达的影响（Mean±SD，n=3）*P＜0.05，vs.干细胞条件培养基培养的SKOV3细胞。

2.4 IL-8增高卵巢癌SKOV3细胞CD44蛋白表达水平 图4展示出：添加rhIL-8（10.0 ng/mL）干细胞条件培养基培养的SKOV3细胞CD133蛋白表达水平显著的增高（P＜0.05）。

图4 IL-8对SKOV3细胞CD44蛋白表达的影响（Mean±SD，n=3）*P＜0.05，vs.干细胞条件培养基培养的SKOV3细胞。

3 讨论

IL-8是一种具有促进中性粒细胞趋化和脱颗粒相关的促炎性趋化因子。该趋化因子激活两种细胞表面G蛋白偶联受体（CXCR1和CXCR2）下游多条细胞内信号通路。在肿瘤细胞，内皮细胞，浸润嗜中性粒细胞和肿瘤相关巨噬细胞，已鉴定IL-8和/或其受体的表达明显增加，提示IL-8可能是肿瘤微环境中重要调节因子。Tsuyada等［7］报道乳腺癌细胞分泌多种细胞因子（包括IL-8）激活乳腺癌相关成纤维细胞STAT3，依次，乳腺癌相关成纤维细胞分泌趋化因子（CC基序）配体2（CCL2）诱导乳腺癌肿瘤干细胞特征，构成一个“癌-间质-癌”信号回路。然而，IL-8是否能直接促成卵巢癌SKOV3细胞系细胞CSLCs特性还有待实验研究验证。为了确定IL-8是否与卵巢癌SKOV3细胞CSLCs功能和特性直接因果性联系，我们通过对比检测在干细胞条件培养基中添加rhIL-8和干细胞条件培养基处理的SKOV3细胞肿瘤球形成率和软琼脂集落形成率。结果证明：rhIL-8显著地增强SKOV3细胞体外致瘤性，包括CSLCs的自我更新和锚定非依赖性生长潜能。

特别重要的是，添加rhIL-8的干细胞条件培养基明显上调肿瘤干细胞标志蛋白CD133和CD44表达。因此，我们的实验结果提供了清楚的证据表明：IL-8能够直接导致SKOV3细胞CSLCs特性获得。本文的研究成果为深入研究肿瘤细胞、肿瘤干样细胞自分泌以及与肿瘤细胞或肿瘤干样细胞交互作用的肿瘤相关成纤维细胞或肿瘤相关巨噬细胞分泌IL-8诱导卵巢癌CSLCs特性获得的分子机制提供了参考性依据。

［1］ Lupia M, Cavallaro U. Ovarian cancer stem cells: still an elusive entity?Mol Cancer［J］.2017 Mar 20; 16(1): 64.

［2］ Ning Y, Luo C, Ren K, et al. FOXO3a-mediated suppression of the self-renewal capacity of sphere-forming cells derived from the ovarian cancer SKOV3 cell line by 7-difluoromethoxyl-5, 4'-di-n-octyl genistein［J］. Mol Med Rep.2014, 9(5): 1982-1988.

［3］ Ning YX, Li QX, Ren KQ, et al. Cao JG.7-difluoromethoxyl-5, 4'-din-octyl genistein inhibits ovarian cancer stem cell characteristics through the downregulation of FOXM1［J］. Oncol Lett.2014, 8(1):295-300.

［4］ Lee JM, Trepel JB, Choyke P, et al. CECs and IL-8 Have Prognostic and Predictive Utility in Patients with Recurrent Platinum-Sensitive-Ovarian Cancer: Biomarker Correlates from the Randomized Phase-2 Trial of Olaparib and Cediranib Compared with Olaparib in Recurrent Platinum-Sensitive Ovarian Cancer［J］. Front Oncol,2015, 5: 123.

［5］ Stronach EA, Cunnea P, Turner C, et al. The role of interleukin-8(IL-8) and IL-8 receptors in platinum response in high grade serous ovariancarcinoma[J]. Oncotarget,2015, 6(31): 31593-31603.

［6］ Liu H, Ren G, Wang T, et al. Aberrantly expressed Fra-1 by IL-6/STAT3 transactivation promotes colorectal cancer aggressivenessthrough epithelial-mesenchymal transition［J］. Carcinogenesis,2015,36(4): 459-468.

［7］ Tsuyada A, Chow A, Wu J, et al. CCL2 mediates cross-talk between cancer cells and stromal fibroblasts that regulates breast cancer stem cells[J]. Cancer Res.2012, 72(11): 2768-2779.

［8］ Zhang CH, Xu GL, Jia WD, et al. Activation of STAT3 signal pathway correlates with twist and E-cadherin expression in hepatocellular carcinoma and their clinical significance[J]. J Surg Res,2012, 174(1):120-129.

Effect of interleukin-8 on characteristics of cancer stem-like cells derived from human ovarian cancer cancer SKOV3 cell line

Yang Jian-Feng1, Xu Chang1, Ning Ying-Xia2, Deng Yu-ao3, Li Xiang1, Li Cheng1, Chen A1, Cui Ying-Hong1
(1. Medical College, Hunan Normal University, Changsha 410013, China;2. Gynaecology and Obstetrics, The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510120, China;3. Department of Gynecology and Obstetrics, Shenzhen People’s Hospital, Shenzhen 518020, China)

ObjectiveTo investigate whether interleukin-8(IL-8) could promote the characteristics of cancer stem-like cells from ovarian cancer SKOV3 cell line.MethodsSKOV3 cells were treated with and without stem cell condition medium addition with recombination human IL-8(rhIL-8: 10.0 ng/mL). Sphere forming ratio and clone forming ratio was detected using sphere forming assay and clone forming assay. The expression of cancer stem cell marker proteins including CD133 and CD44 was analyzed using western blot.ResultsrhIL-8(10.0 ng/mL) significantly increased sphere forming ratio and clone forming ratio in SKOV3 cells. Moreover, the expression of CD133 and CD44 was up-regulated by rhIL-8(10.0 ng/mL).ConclusionrhIL-8 could promote the cancer stem like cells characteristics in SKOV3 cells.

ovarian cancer; cancer stem cell; IL-8; self-renewal; CD133; CD44

A

1673-016X（2017）06-0001-03

2017-08-09

国家自然青年基金 (No．81301894), 广东省科技计划项目(No．2014A020211028)，广州市教育系统科研项目(No．1201410508)；广东省科技计划项目(2014A020242128)

李程，E-mail:1263770390@qq．com