丹参酮ⅡA对黑素瘤细胞侵袭迁移能力的抑制作用及机制

李小静 李志锋 李显平 刘保国 刘志军

056002河北邯郸，河北工程大学附属医院皮肤科

·论著·

丹参酮ⅡA对黑素瘤细胞侵袭迁移能力的抑制作用及机制

李小静 李志锋 李显平 刘保国 刘志军

056002河北邯郸，河北工程大学附属医院皮肤科

目的 探讨丹参酮ⅡA对黑素瘤A375细胞侵袭转移的作用及趋化因子受体7（CXCR7）基因与蛋白表达的影响。方法 体外培养黑素瘤A375细胞，经1、2、4 mg∕L丹参酮ⅡA处理48 h后，细胞划痕实验和Transwell细胞体外侵袭实验分别测定细胞迁移和侵袭能力，实时荧光定量PCR和Western印迹分别检测A375细胞CXCR7 mRNA和蛋白的表达水平。结果 1、2、4 mg∕L丹参酮ⅡA处理A375细胞48 h后，Transwell细胞体外侵袭实验显示，每高倍（×200）视野下迁移穿过聚碳酸酯膜的细胞数分别为71.00±4.00、51.00±2.00、37.00±3.61，而细胞划痕实验显示，细胞迁移数分别为301±3.00、253.00±3.61、126.00±7.00，均显著低于对照组（105.33±6.51、332.00±6.24，均P＜0.05），且丹参酮ⅡA对A375细胞侵袭、迁移能力的抑制作用随丹参酮ⅡA浓度的升高而增强（均P＜0.05）。实时荧光定量PCR及Western印迹显示，1、2、4 mg∕L丹参酮ⅡA组CXCR7 mRNA的相对表达量分别为0.63±0.04、0.44±0.02、0.31±0.01，蛋白表达水平分别为0.573±0.015、0.416±0.011、0.260±0.055，均显著低于对照组（1.00±0.02、0.9000±0.010，均P＜0.05），且丹参酮ⅡA对A375细胞CXCR7 mRNA和蛋白表达的抑制能力随丹参酮ⅡA浓度的升高而增强（均P＜0.05）。结论 丹参酮ⅡA可通过下调CXCR7表达抑制黑素瘤A375细胞的侵袭迁移能力。

黑色素瘤；丹参酮；受体，CCR7；细胞迁移分析；A375细胞

黑素瘤恶性程度高，极易发生侵袭转移，因此临床上将抑制黑素瘤的侵袭转移作为其重要的治疗手段。丹参酮ⅡA是从丹参中提取的化合物，在杀伤肿瘤细胞、诱导其分化与凋亡等方面发挥抑癌作用［1］。目前，丹参酮ⅡA对皮肤黑素瘤的作用仍不清楚。本研究旨在体外观察丹参酮ⅡA对黑素瘤A375细胞侵袭、迁移的影响，并检测其对趋化因子受体7（CXCR7）表达的影响，以探讨其抗肿瘤机制。

材料与方法

一、主要试剂和仪器

兔抗人CXCR7多克隆抗体（美国Santa Cruz公司），Transwell小室（美国Corning公司），Trizol（美国Invitrogen公司），实时荧光定量PCR试剂盒（美国Promega公司），丹参酮ⅡA标准品购自中国食品药品检定研究院，荧光定量PCR仪（美国ABI公司）。

二、细胞培养和实验方法

1.细胞培养：黑素瘤细胞系A375来自美国标准生物品收藏中心（ATCC），采用含10%胎牛血清的高糖Dulbecco极限必需培养基（DMEM）培养，培养条件为37℃、5%CO2。

2.丹参酮ⅡA溶液的配制：取丹参酮ⅡA标准品20 mg溶于2 ml二甲基亚砜中，充分溶解配制10 g∕L丹参酮ⅡA储存液，以每管10 μl分装于1.5 ml尖底离心管中，封口膜及锡纸封闭，储存于-20℃。以预温的含10%胎牛血清的DMEM稀释10 g∕L丹参酮ⅡA储存液1 000倍以上配制不同浓度的丹参酮ⅡA工作液，以使工作液中二甲基亚砜的浓度不超过0.1%，即丹参酮ⅡA工作液最高浓度不超过10 mg∕L。

3.实时荧光定量PCR检测A375细胞CXCR7 mRNA的表达水平：分别采用1、2、4 mg∕L丹参酮ⅡA处理A375细胞48 h，对照组加入含0.1%二甲基亚砜的DMEM。用Trizol试剂分别提取各组总RNA，用紫外分光光度仪测定总RNA的浓度及纯度，A260∕A280吸光度比值在1.9～2.1为合格。各组取大致相等量的总RNA，反转录为cDNA。在基因库上查找CXCR7基因全系列后，CXCR7引物由Primer zpremier 5.0软件设计，用核酸序列数据库检索程序排除其他的可能同源序列，然后由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。CXCR7上游引物5′⁃TTCGTCATCGGCATGATTGC⁃3′，下游引物5′⁃AGTGCGTGTCATAGCCTGTG⁃3′，目的产物79 bp。以β肌动蛋白为内参照。以cDNA为模板进行PCR扩增目的基因片段，反应条件为：95℃预变性2 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环30次；最后72℃再延伸10 min。根据实时荧光定量扩增曲线获取目的基因和内参基因的Ct值，目的基因CXCR7的相对表达量采用2⁃△△Ct计算，△△Ct=（Ct实验-Ct参比）-（Ct对照-Ct参比）。

4.Western印迹检测A375细胞CXCR7蛋白的表达：分别采用1、2、4 mg∕L丹参酮ⅡA处理A375细胞48 h，对照组加入含0.1%二甲基亚砜的DMEM。磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞后，加入预冷的蛋白裂解液裂解细胞，收集上清液，提取各组细胞总蛋白，Broadford法测定蛋白含量。取70 μg蛋白上样，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS⁃PAGE）垂直电泳，分别加入一抗（CXCR7），用封闭液1∶400稀释、二抗（辣根过氧化酶标记抗体，1∶5 000稀释），X线曝光、显影及定影，用各抗体灰度值与3磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）灰度值的比值代表各检测蛋白的相对表达量。每组样本重复实验3次取均值。

5.Transwell实验测定丹参酮ⅡA对A375细胞侵袭能力：在Transwell小室的多聚碳酸酯膜上铺人工基底膜胶，制成人工基底膜。分别用1、2、4 mg∕L丹参酮ⅡA处理A375细胞48 h，胰蛋白酶消化计数后，以无血清培养基调整细胞密度为0.6×106∕ml。将Transwell小室置入24孔板中，在小室中加入无血清培养基，室温放置2 h后，在小室外部加入含10%血清的培养基500 μl，弃去小室内部的无血清培养基，加入300 μl细胞悬液，孵育48 h后染色20 min，干燥后显微镜高倍（×200）视野下计数穿过小室的细胞数。每组实验重复3次取均值。

6.细胞划痕法测定丹参酮ⅡA对A375细胞迁移能力：分别采用1、2、4 mg∕L丹参酮ⅡA处理A375细胞48 h，用10 μl移液枪枪头在单层细胞上呈“一”字划痕，用PBS清洗3次，孵育24 h后换成含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液，孵育24 h后，吸去培养液，用PBS清洗3次后，在高倍镜（×200）下计数迁移到划痕区的细胞数目。

7.统计学方法：采用SPSS16.0统计软件进行分析，实验数据以±s表示，作方差齐性检验，采用单因素方差分析和SNK检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

一、实时荧光定量PCR结果

处理A375细胞48 h后，1、2、4 mg∕L丹参酮ⅡA组及对照组每高倍（×200）视野下迁移穿过聚碳酸酯膜的细胞数分别为71.00±4.00、51.00±2.00、37.00±3.61及105.33±6.51，各组差异有统计学意义（F=140.075，P＜0.001）。SNK检验显示，1、2、4 mg∕L丹参酮ⅡA组迁移细胞数均显著低于对照组（均P＜0.05），且丹参酮ⅡA对A375细胞侵袭能力的抑制作用随丹参酮ⅡA浓度的升高而增强（均P＜0.05）。

二、Western印迹法结果

丹参酮ⅡA处理48 h后，单层细胞划痕24 h后，1、2、4 mg∕L丹参酮ⅡA组及对照组的细胞迁移数分别为301.00±3.00、253.00±3.61、126.00±7.00及332.00±6.24，各组差异有统计学意义（F= 897.236，P＜0.001）。SNK检验显示，1、2、4 mg∕L丹参酮ⅡA组细胞迁移数均显著低于对照组（均P＜0.05），且丹参酮ⅡA对A375细胞迁移能力的抑制作用随丹参酮ⅡA浓度的升高而增强（均P＜0.05）。

三、Transwell实验结果

处理A375细胞48 h后，1、2、4 mg∕L丹参酮ⅡA组及对照组CXCR7 mRNA的相对表达量分别为0.63±0.04、0.44±0.02、0.31±0.01及1.00±0.02，各组差异有统计学意义（F=432.445，P＜0.001）。SNK检验显示，1、2、4 mg∕L丹参酮ⅡA组CXCR7 mRNA相对表达量均显著低于对照组（均P＜0.05），且丹参酮ⅡA对A375细胞CXCR7 mRNA表达的抑制能力随丹参酮ⅡA浓度的升高而增强（均P＜0.05）。

四、细胞划痕法测定结果

处理A375细胞48 h后，1、2、4 mg∕L丹参酮ⅡA组及对照组CXCR7蛋白表达量分别为0.573± 0.015、0.416±0.011、0.260±0.055及0.900±0.010，各组差异有统计学意义（F=251.548，P＜0.001），见图1。SNK检验显示，1、2、4 mg∕L丹参酮ⅡA组CXCR7蛋白表达量均显著低于对照组（均P＜0.05），且丹参酮ⅡA对A375细胞CXCR7蛋白表达的抑制能力随丹参酮ⅡA浓度的升高而增强（均P＜0.05）。

图1 Western印迹检测不同浓度丹参酮ⅡA处理A375细胞后CXCR7蛋白表达的变化 1：对照组；2：1 mg∕L丹参酮ⅡA组；3：2 mg∕L丹参酮ⅡA组；4：4 mg∕L丹参酮ⅡA组。CXCR7：趋化因子受体7；GAPDH：3磷酸甘油醛脱氢酶

讨论

恶性黑素瘤是一种恶性程度较高的皮肤肿瘤，早期黑素瘤可手术切除，但由于其转移率高，对目前治疗方案不敏感，若发生转移则预后极差。丹参酮ⅡA是唇形科鼠尾草属植物丹参干燥根茎的脂溶性活性成分，多项体外研究均证实其对多种血液系统肿瘤及实体瘤有杀伤作用，包括食道癌［1］、膀胱癌［2］、非小细胞肺癌［3］、肝癌［4］等，作用机制主要为抑制肿瘤细胞增殖和诱导其凋亡。丹参酮ⅡA可通过抑制环氧合酶2（COX⁃2）和血管内皮生长因子（VEGF）的表达抑制结直肠癌细胞增殖和血管生成［5］，还可通过mTOR∕p70S6K∕RPS6∕4E⁃BP1信号通路下调缺氧诱导因子⁃1α（HIF⁃1α）和VEGF的表达抑制乳腺癌细胞增殖和血管生成［6］。体外实验显示［7］，丹参酮ⅡA可抑制胃癌SGC7901细胞的迁移和侵袭。为进一步证实丹参酮ⅡA对黑素瘤细胞的体外抑制作用，本研究采用Transwell实验及划痕实验研究丹参酮ⅡA对黑素瘤细胞侵袭及迁移能力的影响。结果显示，1、2、4 mg∕L丹参酮ⅡA作用黑素瘤A375细胞48 h后，随丹参酮ⅡA浓度的增加，对黑素瘤细胞侵袭及迁移的抑制能力增强。

恶性肿瘤转移和炎症细胞浸润过程相似，其中趋化因子及其受体为肿瘤的发生发展及侵袭转移提供了有利的微环境，在肿瘤组织中肿瘤细胞及其间质细胞以自分泌以及旁分泌的方式产生趋化因子，并与趋化因子受体特异性结合，激活相关信号转导通路导致肿瘤细胞的趋化和转移。CXCR7参与多种肿瘤生长、生存和转移过程［8］。研究显示，CXCR7在乳腺癌［9］、胰腺癌［10］等多种肿瘤组织中表达升高，在肾细胞癌中下调CXCR7表达后可诱导癌细胞凋亡，并抑制其侵袭转移［11］。研究表明［12⁃13］，黑素瘤细胞系及正常人表皮黑素细胞存在CXCR7∕CXCL12趋化因子受体及配体共表达，且CXCR7与受体CXCL12结合后可导致正常人表皮黑素细胞CXCL12诱导的迁移过程。本课题组前期研究显示［14］，在黑素瘤组织及黑素瘤细胞株A375和M14细胞中均存在CXCR7蛋白的高表达，提示CXCR7可能影响黑素瘤生物学行为。通过小RNA干扰技术靶向沉默CXCR7表达后，黑素瘤M14细胞侵袭与转移能力被显著抑制，证实CXCR7在黑素瘤侵袭与转移中发挥作用，有望成为黑素瘤潜在的治疗靶点［15］。

本研究在前期研究的基础上进一步检测丹参酮ⅡA作用黑素瘤细胞前后CXCR7基因与蛋白表达的变化，结果显示丹参酮ⅡA组CXCR7 mRNA与蛋白表达均显著低于对照组，且随丹参酮ⅡA浓度的增加而下降，提示丹参酮ⅡA可能通过抑制CXCR7表达，抑制黑素瘤A375细胞侵袭与迁移，但关于丹参酮ⅡA作用后激活的具体信号转导通路还需进一步研究。

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2017中国中西医结合皮肤性病学术年会征文通知

经中国中西医结合学会批准，中国中西医结合学会皮肤性病专业委员会定于2017年4月20-24日在珠海维景国际大酒店召开中国中西医结合皮肤性病学术年会。此次会议将发扬历次年会的优良传统，注重中西医结合治疗皮肤病的新方法及新的研究进展等方面的学术交流，内容密切联系临床，切合皮肤科医师的实际需求，会议将邀请知名专家做特邀演讲，阐述皮肤科相关领域的最新研究进展，创造形式多样、内容充实、紧张热烈、活跃互动的学术交流形式，达到全国皮肤科中医、西医、中西医结合医师共同展现才华、获取知识和信息、增进友谊的目的，欲参加会议者请仔细阅读通知并在规定的时间按要求投稿。

一、投稿要求：①投稿内容：皮肤科基础研究论文、皮肤科临床诊断和治疗等方面的论文、典型与疑难病例等；②投稿方式：中文全文和400字以内的中文摘要，请通过电子邮件投稿，Email：pfkxh@126.com。来稿请注明2017会议征文，截稿日期：2017年3月1日；③会议交流形式：特邀讲演、大会发言、分会发言、书面交流。

二、联系方式：上海市黄浦区成都北路500号峻岭广场19楼1908室，上海长征医院《中国真菌学杂志》编辑部，邮编200003，Email：pfkxh@126.com，联系人：施慧，021-81885497，手机13764560811。

Inhibitory effects of tanshinoneⅡAon migration and invasion of melanoma cells and their mechanisms

Li Xiaojing,Li Zhifeng,Li Xianping,Liu Baoguo,Liu Zhijun
Department of Dermatology,Affiliated Hospital of Hebei University of Engineering,Handan 056002,Hebei, China

s:Liu Baoguo,Email:LBG66@163.com;Liu Zhijun,Email:zlmdsh@126.com

Objective To evaluate effects of tanshinoneⅡAon the invasion and migration of melanoma A375 cells,as well as on the mRNA and protein expression of CXC chemokine receptor type 7（CXCR7）.Methods In vitro cultured A375 cells were divided into 4 groups to be treated with tanshinoneⅡA at different concentrations of 1,2 and 4 mg∕L,and 0.1%dimethyl sulfoxide（DMSO）（control group）for 48 hours,respectively.Wound scratch assay and Transwell invasion assay were conducted to estimate the migratory and invasive abilities of A375 cells,respectively,and real⁃time fluorescence⁃based quantitative PCR（qRT⁃PCR）and Western blot analysis to determine the mRNA and protein expression of CXCR7 in A375 cells,respectively.Results After 48⁃hour treatment,the 1⁃,2⁃and 4⁃mg∕L tanshinoneⅡA groups showed significantly decreased number of A375 cells crossing the polycarbonate membrane per high⁃power field（×200）（71.00±4.00,51.00±2.00 and 37.00±3.61,respectively）in Transwell invasion assay,as well as decreased number of A375 cells migrating to the scratch zone（301±3.00, 253.00±3.61 and 126.00±7.00,respectively）in wound scratch assay,compared with the control group（105.33±6.51,332.00±6.24,respectively,all P＜0.05）.Additionally,qRT⁃PCR and Western blot analysis revealed that the mRNA and protein expression of CXCR7 was significantly lower in the 1⁃,2⁃and 4⁃mg∕L tanshinoneⅡA groups than in the control groups（CXCR7 mRNA:0.63±0.04,0.44±0.02 and 0.31±0.01 vs.1.00±0.02;CXCR7 protein:0.573±0.015,0.416±0.011 and 0.260±0.055 vs.0.9000± 0.010;all P＜0.05）.Moreover,inhibitory effects of tanshinoneⅡA on the migration and invasion of A375 cells,as well as on the mRNA and protein expression of CXCR7,were significantly enhanced with the increase of tanshinoneⅡA concentrations（all P＜0.05）.Conclusion TanshinoneⅡA can inhibit the migratory and invasive abilities of melanoma A375 cells by down⁃regulating CXCR7 expression.

Melanoma;Tanshinone;Receptors,CCR7;Cell migration assays;A375 cells

刘保国，Email：LBG66@163.com；刘志军，Email：zlmdsh@126.com

10.3760∕cma.j.issn.0412⁃4030.2017.02.008

2016⁃05⁃06）

（本文编辑：周良佳 颜艳）