白细胞介素23在呼吸道合胞病毒感染致Th1、Th2及Th17细胞分化中的作用及机制

冯净净，陈家君，王盛美，揭志军

复旦大学附属上海市第五人民医院呼吸科，上海 200240

·论著·

白细胞介素23在呼吸道合胞病毒感染致Th1、Th2及Th17细胞分化中的作用及机制

冯净净，陈家君，王盛美，揭志军

复旦大学附属上海市第五人民医院呼吸科，上海 200240

本研究旨在探讨白细胞介素23(interleukin 23，IL-23)在呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)感染支气管上皮细胞BEAS-2B后对Th1、Th2和Th17细胞分化的影响及作用机制。将RSV感染BEAS-2B后的上清液与淋巴细胞共孵育，并分别阻断IL-23受体(IL-23 receptor，IL-23R)、IL-23p19亚基及p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)信号通路。应用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测上清液中细胞因子γ干扰素(interferon γ，IFN-γ)、IL-4、IL-17的浓度。同时，应用实时聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)检测相关转录因子(t-bet、gata3、rorγt)和信号转导子(stat4、stat6、stat3)的表达。结果显示，RSV感染后IFN-γ、IL-4和IL-17蛋白表达上调，转录因子及信号转导子的表达也有所增加。阻断IL-23和p38 MAPK信号通路后，Th1、Th2和Th7细胞分泌的细胞因子及转录因子表达均明显下降。结果提示，阻断IL-23后可在基因转导层面抑制RSV感染上皮细胞后诱导的Th1、Th2和Th17细胞分化，此过程可能与p38 MAPK信号通路有关。

呼吸道合胞病毒；白细胞介素23受体；白细胞介素23 p19亚基；p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路；T辅助细胞；转录因子

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)属副黏病毒科肺炎病毒属[1]。RSV感染是儿童肺炎和毛细支气管炎最常见的病因，也是5岁以下幼儿急性呼吸道感染的最重要病原体[2]。临床研究发现，婴幼儿时期因RSV所致毛细支气管炎住院的儿童，成年后发生哮喘的概率显著增加[3]。但目前为止，其发病机制尚未完全明了。

Th17细胞亚群是近年来发现的一种CD4+辅助T细胞亚群，主要分泌白细胞介素17A (interleukin 17A，IL-17A)、IL-17F、IL-21、IL-22等炎性细胞因子，在防御胞外菌感染，介导慢性炎症、自身免疫病和肿瘤等过程中发挥重要作用[4]。虽然众多研究发现Th17细胞参与RSV感染导致的宿主免疫过程，但具体机制还不清楚，其既有促进炎症反应的作用，又具备抑制炎症反应的功能[5-6]。IL-23是促进Th17细胞亚群增殖和分化不可或缺的细胞因子，由一个新发现的蛋白 p19 与 IL-12 共用亚基 p40 组成[7]。随着研究的深入，发现IL-23不仅参与Th17细胞的增殖和分化，还参与其他Th细胞的分化。如在溃疡性结肠炎模型中，IL-23受体(IL-23 receptor，IL-23R)的缺失不仅导致Th17细胞减少，Th1细胞数量也有所减少[8]。在哮喘模型中，IL-23可通过调节Th2细胞发挥作用。Wakashin等[9]发现，即使在IL-17缺乏的情况下，IL-23 也能介导Th2相关细胞因子的生成和气道嗜酸性粒细胞的募集，提示IL-23无须依赖IL-17即可参与气道过敏性炎症。体外实验中，IL-23/IL-23R信号通路能增加Th2细胞的表达[10]。

在本课题组前期研究中，用RSV感染支气管上皮细胞BEAS-2B，收集感染及未感染RSV的BEAS-2B上清液，与正常人淋巴细胞共孵育，通过流式细胞术检测Th1、Th2、Th17细胞，发现RSV感染后Th1、Th2及Th17细胞均增加。同时还发现，阻断淋巴细胞表面IL-23R后，不仅Th17细胞分化受抑制，Th1和Th2细胞分化也显著受抑制[11]。IL-23通过何种途径影响Th1和Th2细胞分化，猜测阻断IL-23R后，Th1和Th2细胞分化的信号途径被抑制，导致Th1和Th2细胞数量降低。本研究同时阻断IL-23p19，观察其对后续Th细胞系信号转录因子的影响。

p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)是MAPK家族成员之一，通过对细胞内信号的传递，参与细胞对外界刺激的调节反应，是细胞外多种刺激传向胞内信号转导通路的交汇点，抑制MAPK信号转导通路能减少炎性细胞因子的释放。本研究采用p38 MAPK通路抑制剂(SB203580)，探讨该信号通路在RSV感染后Th1、Th2和Th17细胞系转录因子及所分泌的细胞因子γ干扰素(interferon γ，IFN-γ)、IL-4、IL-17变化中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1试剂DMEM培养基、杜氏磷酸盐缓冲液(Dulbecco’s phosphate buffered saline，DPBS)购自Hyclone公司，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自美国Gibco公司，RNA抽提试剂盒Qiagen RNeasy Min Kit、反转录-聚合酶链反应(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)试剂盒 One Step PrimeScript RT-PCR Kit购自宝生物工程(大连)有限公司，p38 MAPK 抑制剂SB203580购自Sigma Aldrich公司，IL-23R及对照抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司，IL-23p19及对照抗体购自eBioscience公司，刺激剂佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)和离子霉素(ionomycin)购自美国BD公司，人细胞因子INF-γ、IL-4和IL-17检测用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒购自欣博盛生物科技有限公司。

1.1.2病毒和细胞RSV A2 株由上海中医药大学喻晓惠赠，来自美国标准生物品收藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)；人喉癌上皮细胞Hep-2、永生型人支气管上皮细胞BEAS-2B由复旦大学附属上海市公共卫生临床中心保存。 Hep-2细胞于含10% FBS的DMEM培养基中，37 ℃、5% CO2培养。待细胞长满单层，将RSV接种于Hep-2细胞，继续在含2% FBS的DMEM维持液中培养，3～5 d后细胞可出现病变，待病变达80%时收获病毒，测半数组织培养感染剂量(50% tissue culture infective dose，TCID50)为1×107/mL时，冻存于-80 ℃备用[12]。

1.2 方法

1.2.1RSV感染BEAS-2B细胞BEAS-2B细胞于含10% FBS的DMEM培养基中，5% CO2、37 ℃培养。将BEAS-2B细胞接种于24孔板，每孔2×105个，每孔培养体积1 mL；次日观察上皮细胞贴壁达60%～70%，弃培养基，用DPBS洗2次；加入感染复数(multiplicity of infection，MOI)为5的RSV悬液300 μL，轻轻摇匀，置37 ℃培养箱中吸附2 h(每30 min轻摇培养瓶1次)；弃去未吸附的病毒液，用DPBS洗细胞2次，加入细胞培养液，72 h后收集细胞培养上清液，800g离心5 min去除细胞杂质。

1.2.2RSV感染BEAS-2B细胞的上清液与淋巴细胞共孵育分离健康人外周血单核细胞，培养箱中静置3 h。因巨噬细胞为贴壁细胞，悬浮的细胞即为淋巴细胞，3 h后轻轻收取悬浮的淋巴细胞。用正常和感染RSV 72 h的BEAS-2B细胞上清液分别处理淋巴细胞，分为6组进行以下干预。①淋巴细胞组(L组)：用1 mL正常BEAS-2B细胞上清液重悬淋巴细胞，调整细胞密度为2×106/mL；②RSV+淋巴细胞组(RL组)：用1 mL感染RSV的BEAS-2B细胞上清液重悬淋巴细胞，调整细胞密度为2×106/mL；③RSV+淋巴细胞+anti-IL-23R组(RL+aIL-23R组)：先将抗anti-IL-23R(5 μg/孔)加入淋巴细胞作用1 h，后加至1 mL感染RSV的BEAS-2B细胞上清液中，调整细胞密度为2×106个/mL；④RSV+淋巴细胞+anti-IL-23R对照抗体组(RL+aIL-23R cab组)：先将抗anti-IL-23R(5 μg/孔)对照抗体anti-rabbit IgG加入淋巴细胞中作用1 h，后加至1 mL感染RSV的BEAS-2B细胞上清液中，调整细胞密度为2×106个/mL；⑤RSV+淋巴细胞+anti-IL-23p19组(RL+aIL-23p19组)：先将抗anti-IL-23p19(0.5 μg/孔)加入BEAS-2B细胞上清液中作用1 h，后加入淋巴细胞，调整细胞密度为2×106个/mL；⑥RSV+淋巴细胞+anti-IL-23p19对照抗体组(RL+aIL-23p19 cab组)：先将抗anti-IL-23p19(0.5 μg/孔)对照抗体mouse IgG1加入BEAS-2B细胞上清液中作用1 h，后加入淋巴细胞，调整细胞密度为2×106个/mL。

干预淋巴细胞时，各组同时加入PMA(50 ng/mL)和离子霉素(1 μg/mL)以激活淋巴细胞，培养箱中作用12 h，然后收集淋巴细胞及上清液。

1.2.3阻断p38MAPK信号通路后Th细胞相关转录因子的变化淋巴细胞的获取步骤同前，实验分两组：RSV+淋巴细胞组(RL组)和RSV+淋巴细胞+SB203580组(RL+SB203580组)。先将20 μmol/L[13]SB203580加入淋巴细胞中作用1 h，后加至1 mL感染RSV的BEAS-2B细胞上清液中。后续步骤同前。

1.2.4ELISA检测各组上清液中IL-17、IL-4、IFN-γ的变化按ELISA试剂盒说明书检测细胞培养上清液中IFN-γ、IL-4、IL-17表达水平。

1.2.5实时PCR检测淋巴细胞中Th1、Th2和Th17细胞分化相关转录因子根据说明书步骤抽提各组淋巴细胞总RNA，实时定量PCR检测Th1、Th2、Th17细胞亚群分化相关转录因子(t-bet、gata3、rorγt)和信号转导子(stat4、stat6、stat3)的变化，GAPDH作为管家基因。反应体系共25 μL，包括2×Buffer 12.5 μL、ExTaqHS 0.5 μL、Enzyme Mix 0.5 μL、上下游引物各0.75 μL、H2O 6.25 μL、RNA模板2.5 μL，用VII7扩增仪进行。反应条件为：反转录42 ℃ 30 min，预变性95 ℃ 1 min，然后变性95 ℃ 5 s，退火延伸60 ℃ 30 s，40个循环。于退火延伸温度时收集荧光信号，绘制溶解曲线。引物序列见表1。将每个反应管内荧光信号达设定域值时所经历的循环数(cycle threshold，CT)，经2-ΔΔCT计算，获得相对表达量。实验技术路线见图1。

1.3 统计学分析

采用 GraphPad Prism 5 统计软件处理数据，数据以mean±SEM表示，两组间比较用独立样本t检验。组间数据为非正态分布或方差不齐时，采用多个独立样本的Kruskal-WallisH检验，P<0.05为有显著性差异。

表1PCR引物

Tab.1PrimersusedforPCR

PrimerSequence(5'-3')Size(bp)GAPDHF5'-ACGGATTTGGTCGTATTGGG-3'218R5'-ATCTCGCTCCTGGAAGATGG-3'T-betF5'-CCTGTTGTGGTCCAAGTTCA-3'129R5'-GAAGGACAGGAATGGGAACA-3'GATA3F5'-GGGCAATCAGTGTTACCGTT-3'278R5'-ACCACCTTAGGCCAACTGAA-3'STAT4F5'-AATCAGCAAATGGGAGCCTGTC-3'116R5'-CTGCGTTTCAAAGCTGATGGAG-3'STAT3F5'-ACCAGCAGTATAGCCGCTTC-3'106R5'-GCCACAATCCGGGCAATCT-3'RORγtF5'-CCAGTCCACTGATCTTGGGT-3'278R5'-CAAGAGAGGTTCTGGGCAAG-3'STAT6F5'-GCACTGACTGGAAGGGAAGT-3'145R5'-AACCTGTGCTCTTACCCAGC-3'

图1实验技术路线

Fig.1Schemeoftheexperimentalroute

2 结果

2.1 上清液中IFN-γ、IL-4、IL-17的变化

ELISA结果显示，RSV感染BEAS-2B细胞的上清液能使淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-4、IL-17增多，但阻断IL-23受体及亚基p19后，IFN-γ、IL-4、IL-17表达均有所下降，不同阻断剂之间无明显差异(图2)。

2.2Th1、Th2和Th17细胞分化相关转录因子的变化

与对照组相比，RNA水平上RSV感染的BEAS-2B细胞上清液使Th1、Th2和Th17细胞分化相关转录因子(t-bet、gata3、rorγt)和信号转导子(stat4、stat6、stat3)表达均有不同程度的升高。不论阻断IL-23受体还是阻断亚基p19，Th1、Th2和Th17细胞的信号转导途径均被不同程度抑制，不同阻断剂之间Th1、Th17细胞相关转录因子(t-bet、rorγt)和信号转导子(stat4、stat3)的表达无显著差异。但阻断IL-23p19后，Th2细胞分化相关转录因子gata3及信号转导子stat6较阻断IL-23R有更明显的下降趋势(图3)。

2.3阻断p38MAPK信号通路后Th1、Th2、Th17细胞分泌细胞因子及相关转录因子的变化阻断p38 MAPK信号通路后，Th1、Th2和Th17细胞分泌IFN-γ、IL-4、IL-17均有不同程度下降。Th1、Th2和Th17细胞亚群分化相关转录因子(t-bet、gata3、rorγt)和信号转导子(stat4、stat6、stat3)mRNA的表达也均有不同程度下降(图4)。

#P<0.05,##P<0.01 compared with L group;*P<0.05,**P<0.01 compared with RL group.

图2阻断淋巴细胞表面IL-23R、培养体系IL-23p19后IFN-γ、IL-4、IL-17分泌的变化

Fig.2ConcentrationsofIFN-γ,IL-4andIL-17insupernatantsafterblockageofIL-23RandIL-23p19

#P<0.05,##P<0.01 compared with L group;*P<0.05,**P<0.01 compared with RL group;△P<0.05,△△△P<0.001.

图3阻断淋巴细胞表面IL-23R、培养体系IL-23p19后Th1、Th2和Th17细胞相关转录因子的变化

Fig.3RelativeexpressionsoftranscriptionfactorsinlymphocytesafterblockageofIL-23RandIL-23p19

*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 compared with RL group.

图4阻断p38MAPK信号通路后Th1、Th2和Th17细胞分泌细胞因子及相关转录因子的变化

Fig.4ConcentrationsofIFN-γ,IL-4andIL-17insupernatantsandrelativeexpressionsoftranscriptionfactorsinlymphocytesafterblockageofp38MAPKsignalpathway

3 讨论

人支气管上皮细胞受感染后能分泌前炎性细胞因子，从而激活宿主的免疫防御机制。RSV无论感染原代气道上皮细胞(primary airway epithelial cell，AEC)还是气道上皮细胞系BEAS-2B，均能产生IL-8、IL-6、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)等介质[14]。本课题组前期研究发现，RSV感染BEAS-2B细胞后，能刺激细胞分泌Th1和Th17分化相关的细胞因子IL-12、IL-23、IL-6、转化生长因子β(transforming growth factor β, TGF-β)，在这些细胞因子的作用下引起Th细胞亚群的异常漂移。Qin 等[15]建立RSV持续感染人气道上皮细胞(human bronchial epithelial cell，HBEC)模型，其上清液能促使Th细胞亚群向Th1、Th2、Th17方向分化。本课题组前期研究也发现，RSV感染BEAS-2B细胞的上清液使Th1、Th2、Th17细胞分化增加，但阻断IL-23/IL-23R通路后，三细胞系的比例均下降。本研究沿用以前建立的实验体系，即通过建立体外RSV感染BEAS-2B细胞模型，将RSV感染的上皮细胞上清液与人外周淋巴细胞共孵育，分别阻断淋巴细胞表面IL-23R和IL-23p19，检测Th细胞分化相关调控基因的变化，以探讨阻断IL-23后三细胞系下降的原因。

结果显示，RSV感染后三细胞系分泌的细胞因子IFN-γ、IL-4和IL-17均有不同程度升高。相应地，相关转录因子在RSV刺激下表达较对照组有所增加。阻断IL-23后，三细胞系分化相关转录因子均有不同程度下降，表明IL-23可在基因转导层面影响三细胞系的分化。很多研究证实，Th1与Th17细胞关系密切，且IL-23在其中起重要作用。Ahern等[8]发现，缺失IL-23R信号后，炎症性肠病中Th1和Th17细胞数量有所减少。近期动物实验证实，Th17有向Th1细胞转化的可塑性[16]。人Th17细胞表面不但表达CCR6和IL-23R，还表达IL-12Rβ2和CD161，以及Th1和Th17细胞相关转录因子t-bet和rorc。一部分细胞同时能产生IFN-γ和IL-17A，称为Th1/Th17细胞[17]。本研究结果也显示，阻断IL-23后Th1和Th17细胞相关转录因子(t-bet、rorγt)和信号转导子(stat4、stat3)的基因表达有所下降。不同的阻断途径，即阻断IL-23R与IL-23p19之间，两系细胞转录因子的表达无显著差异。

IL-23与Th2细胞亚群的关系也非常密切。Wakashin等[9]研究显示，不论是正常小鼠还是IL-17缺乏小鼠，IL-23均能介导抗原诱导的Th2细胞因子产生和气道嗜酸性粒细胞募集，提示IL-23可能不依赖IL-17途径调节过敏性气道炎症。Peng等[10]的研究也证明，IL-23缺乏可通过减少嗜酸性粒细胞募集和Th2细胞产生来减轻气道炎症反应，T细胞特异性IL-23R 的过度表达能加重Th2样反应和气道炎症，缺乏IL-23能部分抑制Th2细胞的分化，IL-23敲除小鼠脾细胞中Th2细胞亚群的量也显著减少；体外实验表明，IL-23能独立调控Th2细胞的致病作用，而不通过它促进Th17细胞的作用，IL-23/IL-23R信号能促使GATA-3和Th2细胞因子的表达。Cosmi等[18]发现，有少部分细胞能同时分泌IL-17A和IL-4，即Th17/Th2细胞，其表面可少量表达IL-23R。因此，阻断IL-23后，Th2细胞相关转录因子gata3、stat6及特异分泌因子IL-4的表达也降低。本研究还显示，相对于阻断IL-23R，阻断IL-23p19后IL-4分泌有更下降的趋势，但无统计学意义，而转录因子和信号转导子gata3及stat6明显下降。可能相对于蛋白层面，基因层面表现得更突出、更敏感。但阻断IL-23p19导致Th2细胞转录因子进一步下降的原因还不清楚，是否IL-23p19的阻断影响其他途径的Th2细胞产生方式，还需进一步研究。

MAPK是多种细胞外刺激传向胞内信号通路的交汇处。p38 MAPK是MAPK家族成员之一，抑制MAPK信号通路能减少炎性细胞因子的释放。Janus激酶/信号转导和转录活化因子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription, JAK/STAT)信号通路在多种炎症性疾病中也发挥重要作用。Shan等[19]研究发现，胸腺基质淋巴细胞生成素(thymic stromal lymphopoietin, TSLP)可通过MAPK和STAT3信号通路刺激人气道平滑肌细胞表达炎性细胞因子。Wang等[20]研究发现，人肺微血管内皮细胞在组织缺氧情况下分泌IL-6，IL-6激活JAK/STAT途径，抑制p38 MAPK信号通路，可抑制IL-6产生，从而使p-STAT3减少。这些研究提示，STAT3与 p38 MAPK信号通路可能相关。Choi等[21]研究表明，p38 MAPK信号通路的激活与RSV和甲型流感病毒的感染及复制关系密切，抑制该信号通路后可抑制两种病毒复制。Migita等[22]发现，血清类淀粉样蛋白A能刺激类风湿关节炎患者滑膜细胞分泌IL-23p19，该过程可被p38 MAPK抑制剂完全抑制，推测RSV感染引起的IL-23分泌可能是通过p38 MAPK信号途径。本研究通过阻断淋巴细胞中p38 MAPK信号通路，观察其对RSV感染导致Th细胞系分泌细胞因子及转录因子升高的影响。结果显示，三系细胞分泌的细胞因子及分化相关转录因子在SB203580作用下均表达下降，与阻断IL-23的结果一致，提示阻断IL-23信号导致的三系细胞分泌细胞因子下降可能与p38 MAPK信号通路有关。

综上所述，本研究发现RSV感染支气管上皮细胞后，能促进Th1、Th2和Th17相关细胞因子及转录因子的表达，而阻断IL-23或使用p38 MAPK抑制剂能显著抑制这些因子的表达。因此，IL-23在调控RSV感染上皮细胞后诱导的Th1、Th2和Th17细胞分化过程中起重要作用，这可能与p38 MAPK信号通路有关。本研究有助于阐明RSV感染后的宿主免疫反应和免疫调控机制。

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. JIE Zhijun, E-mail: jiezjlxh@163.com

Roleofinterleukin23infacilitatingTh1,Th2andTh17differentiationafterrespiratorysyncytialvirusinfection

FENG Jingjing, CHEN Jiajun, WANG Shengmei, JIE Zhijun

DepartmentofRespiratoryMedicine,ShanghaiFifthPeople’sHospital,FudanUniversity,Shanghai200240,China

The present paper aims to investigate the role of interleukin 23 (IL-23) in facilitating Th1, Th2 and Th17 differentiation during respiratory syncytial virus (RSV) infection of epithelial cells (BEAS-2B). Lymphocytes were treated by supernatants from BEAS-2B cells with RSV or mock infection. Then they were blocked by specific anti-IL-23R antibody, anti-IL-23p19 antibody and p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) inhibitor (SB203580). The concentrations of cytokines such as interferon γ (IFN-γ), IL-4 and IL-17 were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The mRNA expressions of transcription factors (t-bet,gata3,rorγt), signal transducers (stat4,stat6,stat3) were determined by real-time polymerase chain reaction (PCR). The results showed that the concentrations of cytokines (IFN-γ, IL-4 and IL-17) were significantly increased after RSV infection, accompanied with the enhanced expressions of transcription factors. However, these cytokines and transcription factors were significantly decreased when IL-23 pathway was blocked by antibodies. The blockage of p38 MAPK signal pathway showed the same results. The results suggest that IL-23 could facilitate Th1, Th2 and Th17 differentiation in RSV-infected BEAS-2B cells, which might be associated with p38 MAPK signal pathway.

Respiratory syncytial virus; Interleukin 23 receptor；Interleukin 23 p19 subunit; p38 mitogen-activated protein kinase signal pathway; T helper cell; Transcription factor

上海市闵行区自然科学基金(2014MHZ056)，上海市卫生和计划生育委员会科研课题(20164Y0264)

揭志军

2017-02-10)