□ 林祥群 新疆石河子职业技术学院 刘文玉 石河子大学 颜雪琴 新疆石河子职业技术学院 魏长庆 石河子大学
红枣果醋醋酸菌株的分离鉴定
□ 林祥群 新疆石河子职业技术学院 刘文玉 石河子大学 颜雪琴 新疆石河子职业技术学院 魏长庆 石河子大学
果醋作为一种新型保健饮料,因其营养丰富、风味独特、口感俱佳而备受广大消费者的欢迎。红枣果醋就是以红枣为主要原料,经酒精和醋酸发酵而成,既可作为调味品,又可作为饮料直接饮用。该文从红枣的营养、加工现状等方面综述红枣果醋的研究进展,说明红枣果醋的开发具有广阔的前景。
红枣;营养成分;果醋;研究进展
本研究以石河子市150团红枣产区为主要采样地点,采集样品包括红枣种植园的土样、红枣树叶以及新鲜红枣,用富集培养法和平板筛选法进行菌株的初筛,从中筛选出11株醋酸菌,摇瓶发酵法复筛,在复筛过程研究其发酵产酸能力,确定工作菌株L-9,然后对工作菌株的生长特性和生理生化特点研究,对菌株进行鉴定,为优质红枣果醋的发酵打下良好的菌种基础。
2.1 材料
2.1.1 采样原料
原料:红枣果园土壤、红枣果树树叶、市场购买的鲜枣(放置软烂)。
对照菌株为ASI.41(A.rancens L.),本文中简写为A,来自石河子大学食品学院食品生物技术实验室。
2.1.2 培养基
(1)初筛培养基:酵母膏1%、葡萄糖1%、CaCO31%、琼脂1.5%,灭菌后加无水乙醇6%(v/v),自然pH值。
(2)复筛培养基:葡萄糖1%、酵母膏l%,灭菌后加入无水乙醇6%,自然pH值。
试管培养基:酵母膏1%、葡萄糖1%、CaCO30.5%、琼脂2.0%、无水乙醇3%(v/v),自然pH值。
2.1.3 主要试剂
氢氧化钠、氯化钾、磷酸氢二钾、氧化钙、3,5-二硝基水杨酸、硝酸钠,以上试剂均为分析纯。
2.1.4 主要仪器设备
分光光度计、离心机、高压灭菌锅、恒温水浴槽、显微镜、电子天平、恒温恒湿摇床及酸度计等。
2 2 方法
2.2.1 菌源制备及富集培养
原料1:市购1 kg新鲜红枣,放置自然软烂,置于500 ml三角瓶中,用四层纱布封口,自然酒精发酵。用手持糖度仪测其糖度,当糖度降到4°BX,对原料打浆涂布平板初筛培养基分离菌株。
从石河子醋厂采取的醋醅2 g,放入有50 mL蒸馏水的250 mL三角瓶中,30℃摇培3 d后进行菌株筛选。
原料2:150团红枣种植园采集土壤,混和于无菌蒸馏水,涂布平板初筛培养基分离菌株。
原料3:150团红枣种植园采集红枣树叶,将树叶用无菌手术刀剪切,放置于涂布平板初筛培养基分离菌株。
2.2.2 挑选醋酸菌
将稀释涂布生长72 h的菌株中形态与醋酸菌相似的菌落接种于复筛培养基中,30 ℃培养72 h,吸取1 mL培养液于平板培养基,涂布分离,30 ℃培养72 h,选择透明圈大的单菌落接种于斜面培养基保存。
2.2.3 醋酸菌定性试验
将筛选出的菌株接种于摇瓶培养基中,摇床30 ℃培养72 h后,培养液以15 min、4 500 r/min的转速离心除去菌体,吸取5 mL上清夜,以0.1 mol/L氢氧化钠中和至pH 7.0,将中和液煮沸,加入0.1 mol/L氯化铁溶液5滴,有红褐色沉淀产生者为产醋酸菌。
2.2.4 醋酸菌定量试验
将筛选出的醋酸菌分别接种于醋酸菌三角瓶培养基中,摇床30 ℃培养3 d后,采用碱式滴定法(以醋酸计)测其产酸量,从中筛选产酸量高的菌株进行复筛。
滴定时,取2 mL发酵液于250 mL的三角瓶内,加入50 mL蒸馏水,3~5滴0.5%的酚酞酒溶液,用标定的0.IN的氢氧化钠溶液滴至浅粉红色,由耗用的氢氧化钠溶液的体积计算样品中的含酸量,每个处理均以3个平行样的平均结果计算,选择产酸量大的。
2.2.5 醋酸菌鉴定分类方法
菌落形态观察:在平板培养基上用划线分离方法培养细菌,20 ℃培养24 h,肉眼观察单菌落形态。
菌体形态观察:涂片固定培养至对数期的细胞,革兰氏染色,镜检。
培养特征观察:液体培养基培养48 h,观察。
表1 醋酸菌定量试验结果(单位:g/L)
表2 产酯试验结果(单位:g/L)
3.1 菌株分离纯化
从软烂红枣中筛选出16株菌,对其编号为H1-16;从果园土壤中筛选出5株菌,编号为T1-5;从红枣果树树叶中筛选出3株菌,对其编号为S1-3。
3.2 醋酸菌定性试验
对筛选出的24株菌进行醋酸菌定性试验,发现有11株菌株为醋酸菌。
3.3 醋酸菌定量试验
对筛选的11株菌和对照菌株ASI.41(A.rancens L.)进行产酸量试验。结果见表1。
由表1可以看出菌株H2、H5、H9、H11的产酸量均大于对照菌株A,故选择H2、H5、H9、H11四株菌株进行醋酸菌产酯试验。
3.4 醋酸菌产酯试验
对H2、H5、H9、H11进行产酯试验。试验结果见表2。
由表2可知菌株H9的产酯量与对照A的产酯量相差不大,所以选H9作为工作菌株,进行下一步研究。
3.5 醋酸菌鉴定分类
H9在固体培养基上菌落表面光滑,呈圆形,有凸起,菌落周围有明显的碳酸钙溶解圈;液体培养基中培养基变浑浊,有明显的醋酸味。革兰氏染色阴性,无芽孢,菌体短杆状,单个或成对、成链排列。
本试验从软烂的红枣、红枣园土壤、红枣树树叶中筛选出醋酸菌株24株,并对它们进行醋酸菌定性试验,筛选出产醋酸菌11株,对所筛的21株醋酸菌进行醋酸菌定量试验、产酯试验,选取菌株H9作为工作菌株,对H9进行培养特征、形态特征研究,初步鉴定H9为醋酸杆菌属(Pasteurianus-Acetobacter)巴氏醋酸杆菌。
魏长庆。