广西早期梅毒患者梅毒螺旋体基因分型研究

朱邦勇 李伟 段家俊 张杰 韦江平 周志光 黄耿 唐中书 陈羽建 曹娟 甘泉 黄寅杰

530007南宁，广西壮族自治区皮肤病防治研究所中心实验室

广西早期梅毒患者梅毒螺旋体基因分型研究

朱邦勇 李伟 段家俊 张杰 韦江平 周志光 黄耿 唐中书 陈羽建 曹娟 甘泉 黄寅杰

530007南宁，广西壮族自治区皮肤病防治研究所中心实验室

目的了解广西部分市梅毒螺旋体（Tp）的基因分型状况。方法从2012年1月至2016年7月在广西性病门诊收集疑似早期梅毒患者300例，采集皮损处组织液，用镀银染色法检测梅毒螺旋体，同时采用PCR扩增Tp polA基因，进行早期梅毒的诊断。对早期梅毒确诊病例进行Tp的arp基因60个碱基对重复序列的数目、tprⅡ基因MseⅠ酶切后限制性片段长度多态性的型别和tp0548基因序列的型别进行鉴别，依据结果进行综合分析以判断梅毒基因型。结果共确诊早期梅毒患者215例，其中梅毒PCR检测出210例阳性，检出率97.7%，镀银染色法检测出105例阳性，检出率48.8%，PCR法阳性率显著高于镀银染色法（χ2=103.01，P＜0.05）。在PCR阳性标本中，共190例可进行三基因完全分型，总计分出17个基因型别，14d/f有86例（45.3%），具有绝对的流行优势，其他亚型依次为15d/f（13.7%、26/190）、16d/f（11.6%、22/190）、17d/f（7.4%、14/190）、13d/f（6.8%、13/190）、10d/f（4.2%、8/190）、18d/f（1.6%、3/190）、16a/f（1.6%、3/190）、5d/f（1.1%、2/190）、7d/f（1.1%、2/190）、12d/f（1.1%、2/190）、16d/e（1.1%、2/190）、14a/f（1.1%、2/190）、9h/c（1.1%、2/190）、15l/f（0.5%、1/190）、25a/e（0.5%、1/190）、15i/f（0.5%、1/190）。结论广西早期梅毒患者的梅毒螺旋体基因型别具有多样性，其中以14d/f型为优势型。

梅毒；苍白密螺旋体；基因分型技术；聚合酶链反应；银染色法

梅毒分型系统是开展梅毒分子流行病学研究的重要手段。Pillay等［1］首次提出了操作简便、具有实用性的基因分型系统，从而使得对梅毒分子流行病学的研究进入崭新的发展时期。本研究采用三基因定位法（酸性重复蛋白基因arp、梅毒螺旋体重复基因家族tpr和tp0548）进行梅毒螺旋体基因分型，该方法分析出的基因型别有助于研究和分析梅毒传播的性网络关系和范围，为分析梅毒的流行特征、传染源来源、爆发菌株、确定高危核心人群、制定防治策略及其效果评价提供依据。现将结果报告如下。

一、材料与方法

1.主要试剂与仪器：DNA提取试剂盒为美国Qiagen公司产品，DNA聚合酶和dNTPs为美国Promega公司产品。MseⅠ内切酶和100 bp DNA标准参照物为美国NEB公司产品。扩增引物由Invitrogen（上海）贸易有限公司合成。PCR扩增仪（CFX96）和凝胶成像系统（Gel DocTM XR+）均为美国Bio-rad公司产品。

2.对象与标本采集：收集2012年1月至2016年7月广西南宁、玉林、柳州和防城港市性病门诊共300例疑似早期梅毒患者。所有患者有硬下疳或生殖器溃疡、梅毒疹、扁平湿疣或黏膜斑等临床表现。其中男248例，女52例，年龄17～81（37.5±15.28）岁。采集标本时先用无菌氯化钠生理溶液清洗皮损表面，再用钝刀挤压并轻刮皮损表面，避免有血液流出，将渗出液分两部分处理，一份直接进行镀银染色镜检，另一份洗入含有细胞裂解液的标本管中，编号后放入-80℃超低温冰箱中保存。

3.早期梅毒的检测与诊断：

（1）镀银染色法：将组织液涂抹在载玻片上制成薄片，于空气中自然干燥，然后用罗吉固定液固定2～3 min，再用无水乙醇洗涤玻片上的油污后，加鞣酸媒染剂于涂片上，微加热产生蒸汽，染30 s，水洗，加Fontana银染液于涂片上，微加热产生蒸汽，染30 s，水洗后待干，最后用油镜观察特征性的被染成棕褐色的梅毒螺旋体。

（2）Tp特异的polA基因PCR扩增［2］：将Tp Nichols标准株（中国疾病预防控制中心性病控制中心提供）和-80℃超低温条件下冻存的临床株DNA提取液置于室温环境中冻融，16 500×g离心10 min，进行Tp polA PCR扩增。5 μl DNA模板加入50 μl反应体系，包括0.2 mmol/L dNTPs 1 μl、2.5 mmol/L MgCl25 μl、1 × PBS 10 μl、0.6 μmol/L 上游引物（5′-TGCGCGTGTGCGAATGGTGTGGTC-3′）1.5 μl，0.6 μmol/L下游引物（5′-CACAGTGCTCAAAAACGCCTGCACG-3′）1.5 μl、DNA聚合酶2.5 U（0.5 μl）以及双蒸水25.5 μl。反应条件为95℃预变性15 min，95℃ 40 s，65℃ 1 min，72℃ 1 min，共40个循环，72℃延伸5 min。20 μl的PCR扩增产物和100 bp的DNA Marker注入1.5%琼脂糖凝胶，100 V电泳60 min，并在凝胶成像仪中观察结果，目的扩增产物377 bp。

（3）早期梅毒的判断标准：一期梅毒：有硬下疳或生殖器溃疡等临床表现结合病原学检查（镀银染色法或PCR）阳性或梅毒血清学试验阳性［梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA）阳性或甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）］。二期梅毒：有梅毒疹或扁平湿疣或黏膜斑等临床表现并结合病原学检查（镀银染色法或PCR）阳性或梅毒血清学试验（TRUST和TPPA）阳性。

4.分型方法：采用三基因分型法，即将arp基因含有的60个碱基对重复序列的数目、tprⅡ基因MseⅠ酶切后限制性片段长度多态性（RFLP）的型别和tp0548基因序列的型别组成一个完整的基因型别［arp］［tprⅡ］/［tp0548］，对梅毒螺旋体进行基因分型。三种基因分型的PCR方法参考文献［3］，其中arp基因60 bp相似重复序列数目分析，采用Quantity One软件分析确定碱基对数，并与Nichols株（1 155 bp，14个重复序列）进行比对，每相差60 bp的碱基被定义为增加或减少1个重复序列；tprⅡ基因MseⅠ酶切后RFLP分析，将电泳条带与文献记载的16种条带（a～p）比对，确定型别；tp0548基因序列分析，测序结果用DNAstar5.0软件与a～i型标准序列比对，从而确定型别。

5.统计学分析：采用SPSS13.0软件进行分析，计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1.镀银染色法与PCR法检测结果比较：300例疑似早期梅毒病例，根据早期梅毒的判断标准，通过临床表现和实验室4种方法的检测结果及随访检测进行综合分析，最终确诊为早期梅毒215例，另外85例为非梅毒感染病例。在215例确诊的早期梅毒病例中，PCR检测出210例阳性，检出率为97.7%，镀银染色法检测出105例阳性，检出率为48.8%。其中镀银染色阳性标本其PCR结果均为阳性，两种方法经χ2检验发现PCR法阳性率显著高于镀银染色法，χ2=103.01，P＜ 0.05，见表1。在210例PCR阳性病例中，114例为一期梅毒，镀银染色法检出89例阳性（78%），96例为二期梅毒，镀银染色法检出16例阳性（17%），5例两种方法检测为阴性的病例均为二期梅毒。300例中，血清学抗体TPPA和TRUST均阳性196例，其中一期梅毒96例，二期梅毒100例；另外在一期梅毒中TPPA阳性，TRUST阴性12例。

2.三基因定位法对临床菌株的基因型别分析：梅毒PCR检测阳性标本210例，所有阳性标本均进行三基因分型，其中arp基因分型有效菌株195例（92.9%），共分出12个型别（5、7、9、10、12、13、14、15、16、17、18、25），tprⅡ基因分型有效菌株190例（90.5%），共分出5个型别（a、d、h、i、l），tp0548基因分型有效菌株198例（94.3%），共分出3个型别（c、e、f）。综合三基因分型结果有效190个菌株进行综合分析，总计分出17个基因型别，其中14d/f有86例（45.3%），具有绝对的流行优势，其他亚型依次为15d/f（13.7%、26/190）、16d/f（11.6%、22/190）、17d/f（7.4%、14/190）、13d/f（6.8%、13/190）、10d/f（4.2%、8/190）、18d/f（1.6%、3/190）、16a/f（1.6%、3/190）、5d/f（1.1%、2/190）、7d/f（1.1%、2/190）、12d/f（1.1%、2/190）、16d/e（1.1%、2/190）、14a/f（1.1%、2/190）、9h/c（1.1%、2/190）、15l/f（0.5%、1/190）、25a/e（0.5%、1/190）、15i/f（0.5%、1/190）。见图1。

三、讨论

梅毒病原学检测是梅毒实验室诊断的重要手段，其中暗视野显微镜和镀银染色法可直接检测早期梅毒螺旋体，是早期梅毒患者实验室诊断的常用方法，但由于暗视野显微镜价格昂贵，且需要严格的技术和检测时间、较高的环境要求和丰富的经验而限制其普及应用。镀银染色法操作简便，设备要求简单，更易被常规实验室接受而得到普及。同时我们采用PCR技术进行Tp的polA基因检测，对疑似早期梅毒的组织液标本梅毒阳性检出率为97.7%，明显高于镀银染色法阳性检出率（48.8%），这与两者方法操作、人为因素及标本里病原体的含量有直接关系。虽然两方法检出率有一定差异，但不同条件的实验室可采用不同的方法进行早期梅毒的病原学诊断。由于早期梅毒存在抗体窗口期，特别是一期梅毒。本研究发现，一期梅毒血清学抗体均阴性7例，特异性抗体阳性而非特异性抗体阴性12例，因此病原学诊断可作为梅毒血清学诊断的补充，特别是血清学阴性而临床高度怀疑梅毒的患者，从而提高梅毒的诊断效率，做到早诊断早治疗，减少梅毒的传播。

表1 PCR法与镀银染色法对梅毒螺旋体的检测结果分析

图1 广西地区早期梅毒患者190例梅毒螺旋体临床株［arp］［tprⅡ］/［tp0548］三基因分型结果

梅毒螺旋体基因分型系统是梅毒分子流行病学重要的研究手段，有助于阐述基因型别与菌株的毒力、侵袭性之间的关系。我们的研究采用三基因联合的Tp基因分型系统，该系统是基于arp基因、tpr基因和tp0458基因具有高敏感性、高特异性和强区分度的特点，其完整分型敏感性达到90%以上，远高于以往皮损组织液标本双基因完整分型的敏感性（仅80%）［4-6］。本研究综合三基因分型结果进行分析，190份标本共分出17个基因型别，说明广西梅毒基因型具有丰富多样性，其原因可能是梅毒的流行时间较长，患者未经治疗或治疗不彻底，梅毒螺旋体在体内发生变异以及人群的流动性等。另外从型别分析看，14d/f占45.3%，具有绝对的流行优势，这与上海的一项研究结果相似［7］，可能与14d/f基因型的传染性和毒力相对其他型别更强有关，其他的流行型别依次是15d/f（13.7%）、16d/f（11.6%）、17d/f（7.4%）、13d/f（6.8%）和10d/f（4.2%）等。另外本研究仅对皮损组织液进行检测，且只收集广西4市的病例，有一定的局限性。今后应扩展标本类型及扩大更多城市的病例进行基因分型研究，以期反映广西梅毒螺旋体的分子流行病学特征。

［1］Pillay A,Liu H,Chen CY,et al.Molecular subtyping ofTreponema pallidumsubspecies pallidum［J］.Sex Transm Dis,1998,25（8）:408-414.DOI:10.1097/00007435-199809000-00004.

［2］Liu H,Rodes B,Chen CY,et al.New tests for syphilis:rational design of a PCR method for detection ofTreponema pallidumin clinical specimens using unique regions of the DNA polymerase I gene［J］.J Clin Microbiol,2001,39（5）:1941-1946.DOI:10.1128/JCM.39.5.1941-1946.2001.

［3］彭锐锐,尹跃平,魏万惠,等.三基因分型法检测梅毒螺旋体基因型别［J］.中华皮肤科杂志,2011,44（11）:779-782.DOI:10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2011.11.007.

［4］Cole MJ,Chisholm SA,Palmer HM,et al.Molecular epidemiology of syphilis in Scotland［J］.Sex Transm Infect,2009,85（6）:447-451.DOI:10.1136/sti.2009.036301.

［5］曾铁兵,吴移谋,黄澍杰,等.衡阳和江门地区梅毒螺旋体基因分型的初步研究［J］.中华皮肤科杂志,2004,37（12）:692-694.DOI:10.3760/j.issn:0412-4030.2004.12.003.

［6］郑和平,欧志英,胡玉山,等.梅毒螺旋体的巢式PCR检测与基因分型［J］.中华皮肤科杂志,2005,38（9）:546-548.DOI:10.3760/j.issn:0412-4030.2005.09.005.

［7］Dai T,Li K,Lu H,et al.Molecular typing ofTreponema pallidum:a 5-year surveillance in Shanghai,China［J］.J Clin Microbiol,2012,50（11）:3674-3677.DOI:10.1128/JCM.01195-12.

Genotyping of Treponema pallidum in patients with early syphilis in Guangxi province

Zhu Bangyong,Li Wei,Duan Jiajun,Zhang Jie,Wei Jiangping,Zhou Zhiguang,Huang Geng,Tang Zhongshu,Chen Yujian,Cao Juan,Gan Quan,Huang Yinjie
Central Laboratory,Institute of Dermatology,Guangxi Autonomous Region,Nanning 530003,China

Li Wei,Email:13317611981@163.com

ObjectiveTo investigate genotyps ofTreponema pallidum（Tp）in several cities in Guangxi province.MethodsA total of 300 patients with suspected early syphilis were enrolled from STD clinics in Guangxi between January 2012 and July 2016,and tissue fluid samples were collected from skin lesions.Silver staining was performed to detect Tp,and PCR to amplify the Tp polA gene for the diagnosis of early syphilis.Positive samples were subjected to PCR amplification of a 60-bp tandem repeat region within the arp gene,restriction fragment length polymorphism（RFLP）analysis of the tprⅡgene after digestion with MseⅠenzyme and tp0548 genotyping.ResultsFinally,215 patients were diagnosed with early syphilis,including 210（97.7%）patients positive for PCR and 105（48.8%）patients positive for silver staining,and the positive rate significantly differed between the two methods（χ2=103.01,P＜ 0.05）.Among the PCR-positive samples,190 could be genotyped by analysis of three target genes,and 17 genotypes were identified.The genotype 14d/f was predominant（45.3%,86/190）,followed by 15d/f（13.7%,26/190）,16d/f（11.6%,22/190）,17d/f（7.4%,14/190）,13d/f（6.8%,13/190）,10d/f（4.2%,8/190）,18d/f（1.6%,3/190）,16a/f（1.6%,3/190）,5d/f（1.1%,2/190）,7d/f（1.1%,2/190）,12d/f（1.1%,2/190）,16d/e（1.1%,2/190）,14a/f（1.1%,2/190）,9h/c（1.1%,2/190）,15l/f（0.5%,1/190）,25a/e（0.5%,1/190）,15i/f（0.5%,1/190）.ConclusionTp genotypes are diversified in patients with early syphilis in Guangxi,and the genotype 14 d/f is predominant.

Syphilis;Treponema pallidum;Genotyping techniques;Polymerase chain reaction;Silver staining

李伟，Email：13317611981@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2017.05.014

广西医疗卫生适宜技术研究与开发项目（S201539）

Fund program:Appropriate Technology for Health Care Research and Development Projects of Guangxi Province of China（S201539）

2016-08-04）

（本文编辑：颜艳）