基于梅毒核酸疫苗pcD/Tp92的不同接种策略

刘安元 陶立坚 赵铁 赵飞骏 张晓红

410078长沙，中南大学湘雅公共卫生学院（刘安元、陶立坚）；南华大学病原生物研究所特殊病原体防控湖南省重点实验室（张晓红、赵飞骏、赵铁）

基于梅毒核酸疫苗pcD/Tp92的不同接种策略

刘安元 陶立坚 赵铁 赵飞骏 张晓红

410078长沙，中南大学湘雅公共卫生学院（刘安元、陶立坚）；南华大学病原生物研究所特殊病原体防控湖南省重点实验室（张晓红、赵飞骏、赵铁）

目的评估基于梅毒核酸疫苗pcD/Tp92的各接种优化策略对新西兰兔梅毒螺旋体（Tp）皮肤感染的免疫保护效应。方法核酸疫苗pcD/Tp92采用2次肌内注射免疫或肌内注射初免鼻饲加强的免疫方式结合黏膜佐剂CpG ODN及Tp92重组蛋白，分别或联合免疫新西兰兔。酶联免疫吸附法（ELISA）检测各接种策略组免疫期间（0～8周）兔特异性抗体产生及变化水平，免疫8周后兔鼻咽部、阴道黏膜SIgA产生水平及兔脾细胞IL-2、γ干扰素（IFN-γ）诱导水平，噻唑蓝法（MTT）检测兔脾淋巴细胞增殖水平。记录各组在初次免疫后第10周兔皮下接种Tp标准株感染后接种部位感染早期皮损的变化。结果采用pcD/Tp92核酸疫苗肌内注射初免，CpG-ODN联合Tp92重组蛋白抗原鼻饲新西兰兔加强免疫的接种策略组（C2组）分别与pcD/Tp92疫苗肌注组（A2组），pcD/Tp92疫苗肌注初免，pcD/Tp92鼻饲加强免疫组（B1组）或结合黏膜佐剂CpG ODN联合免疫的接种策略组（B2组）相比，既能促进pcD/Tp92核酸疫苗在兔体内免疫期间（8周）诱生更高特异性抗体水平（C2组：1.825 ± 0.175；A2组：1.372 ± 0.322；B1组：0.893 ± 0.297；B2组：1.294 ± 0.124；P＜ 0.05），IL-2（C2组：154.7± 14.6；A2组：112.3± 13.4；B1组：76.6± 21.5；B2组：97.3± 18.7；P＜ 0.05）及IFN-γ（C2组：277.4± 24.4；A2组：232.8± 25.3；B1组：165.7± 22.6；B2组：211.3± 24.6；P＜ 0.05）分泌水平，以及更高的T细胞增殖分化水平（SI C2组：3.57±0.24；A2组：3.08±0.22；B1组：2.12±0.14；B2组：2.88±0.18；P＜0.05），还能刺激更高的黏膜特异性SIgA抗体，导致最低Tp感染部位皮损Tp阳性率（6.67%）及溃疡病灶形成率（6.67%）从而达到有效的保护作用。结论pcD/Tp92核酸疫苗肌内注射初免，CpG ODN联合Tp92重组蛋白鼻饲加强免疫的接种策略能在新西兰兔体内诱导最强的黏膜免疫和免疫保护效应。

梅毒；苍白密螺旋体；疫苗；DNA；免疫；黏膜；兔；Tp92；CpG-ODN

Fund program:National Natural Science Foundation（81373230,81301470）

梅毒是梅毒螺旋体（Treponema Pallidun，Tp）感染引起的危害人类健康的性传播疾病。近年来，全球梅毒发病率逐年上升［1］，中国梅毒发病率也呈增长趋势［2］，因此，研制安全有效的梅毒疫苗，成为控制该病的关键之一。机体免疫系统的局部黏膜效应在应对早期抗Tp感染过程中发挥着重要的作用，而单一的梅毒核酸疫苗或蛋白疫苗通过肌注方式免疫新西兰兔虽能刺激产生较强的系统免疫应答，但对黏膜免疫系统的有效刺激显得很局限，难以获得有效的免疫保护效果［3-4］。近年来，大量疫苗的研究采用核酸疫苗初次免疫，继而用相应蛋白疫苗加强免疫的联合免疫策略，显示免疫保护性应答效应较单一核酸疫苗或蛋白疫苗有所提高［5-7］。CpGODN有促进黏膜免疫和增强免疫原性的双重功能，是一种具应用前景的黏膜佐剂［8-10］。基于此，本研究一方面在初步验证pcD/Tp92核酸疫苗免疫效应的基础上，用CpG-ODN的黏膜佐剂结合肌注初次免疫，鼻饲加强免疫接种模式强化诱导机体免疫应答；另一方面采用pcD/Tp92核酸疫苗肌注初免，CpG-ODN联合Tp92重组蛋白鼻饲免疫加强新策略免疫新西兰兔，期望能有效激发和增强免疫兔的全身免疫效应。

资料和方法

一、资料

1.实验动物：新西兰雌性大白兔（SYXK湘2010-0006）由南华大学医学科学研究中心实验动物部提供并饲养，饲养室温保持18～20℃，喂养用饲料和饮用水保证无抗生素。

2.菌株和质粒：Tp Nichols标准株由上海市皮肤病性病医院检验科顾伟鸣主任和厦门大学中山医院检验科杨天赐主任惠赠并由南华大学医学院病原生物研究所传代保存。E.coli BL21（DE3）株、重组质粒pcDNA3.1（+）/Tp92和PET43.1a（+）/Tp92由本研究所成功构建并保存［2］。

3.主要试剂：Toxin EraserTMEndotoxin Removal试剂盒（美国GenScript公司），BCA微量蛋白试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），CpG ODN序列（TCCATGACGTTCCTGACGTT）由Invitrogen（上海）贸易有限公司合成，HRP标记山羊抗人/兔IgG二抗（美国Invitrogen公司），兔IFN-γ、IL-2及兔IgA ELISA定量检测试剂盒（美国RayBiotech公司），FBS和RPMI1640培养基（美国HyClone公司）。

二、方法

1.核酸疫苗的制备及纯化：按文献［3］所述，大量提取重组质粒pcD/Tp92和空质粒pcDNA3.1（+），纯化后溶于pH7.3的无菌PBS溶液中，调整质粒浓度为0.2 mg/ml。

2.重组蛋白的表达、纯化及鉴定：将重组质粒PET43.1a（+）/Tp92转入E.coli BL21（DE3）扩大培养至对数期，16 ℃，IPTG（0.2 mmol/L）诱导表达6 h，菌液12 300×g离心8 min收集沉淀，裂解后取上清层析过柱；4℃，2 000×g离心40 min，加入PBS 4～5次洗净蛋白。透析浓缩蛋白，去内毒素后调整蛋白浓度为0.03 mg/ml备用。用His标签抗体或梅毒阳性人血清为一抗，HRP标记的羊抗兔/人抗体为二抗，免疫印迹实验鉴定纯化蛋白。

3.免疫接种策略的实施及感染实验：将新西兰兔分为对照组A1，疫苗免疫策略实施组A2、B1、B2、C1、C2共6个组，每组18只。免疫接种策略实施如下：A1组pcD（100 μg）肌注免疫 2次；A2组 pcD/Tp92（100 μg）肌注免疫2次；B1组pcD/Tp92（100 μg）初次肌注免疫，pcD/Tp92（100 μg）鼻饲加强免疫；B2组pcD/Tp92（100 μg）初次肌注免疫，pcD/Tp92（100 μg）联合CpGODN（10 μg）鼻饲加强免疫；C1组pcD/Tp92（100 μg）初次肌注免疫，Tp92 重组蛋白（50 μg）鼻饲加强免疫；C2组pcD/Tp92（100 μg）初次肌注免疫，Tp92 重组蛋白（50 μg）联合CpGODN（10 μg）鼻饲加强免疫。两次免疫时间间隔2周。初次免疫后8周，每组随机取3只兔用于脾细胞增殖试验、细胞因子分泌检测及鼻咽部、阴道黏膜SIgA分泌水平检测。初次免疫后10周左右，将6个组剩余15只兔背部剃毛后，皮下接种8个皮丘，每个皮丘位点接种Tp Nichols株菌量为105个左右。每隔3天记录测量0～60 d感染部位皮损红肿、溃烂变化及愈合时间情况，在背部皮肤感染21 d左右暗视野和镀银染色检查记录皮损Tp阳性率及皮损溃疡病灶形成率。

4.实验组不同时间点兔血清特异性Tp92抗体水平检测：参照文献［3］，6个组（n=18）在初次免疫后第0周（免疫当天）、2、4、6、8周5个时间点分别进行兔耳缘静脉采血1 ml，分离血清。间接ELISA法检测血清特异性Tp92抗体水平：将1∶50稀释的Tp92重组蛋白4℃包被96孔酶标板过夜，37℃10%BSA-PBS液封闭酶标板1 h，PBS多次洗涤后，加入经倍比稀释的不同浓度的待测免疫兔血清，用梅毒阳性兔血清做阳性对照，37℃孵育1h后洗涤，加入HRP标记的羊抗兔IgG（1∶2 000）二抗，37℃孵育1 h后洗涤，TMB显色，酶标仪读取450 nm波长的A值，每个样本重复检测3次，取均值。

5.兔免疫后鼻咽部及阴道冲洗液中IgA水平测定及脾淋巴细胞培养上清细胞因子IFN-γ及IL-2水平的检测：参照文献［3］，各实验组在免疫后第8周随机处理3只兔，分别用500 μl的PBS溶液连续冲洗鼻咽部或从阴道口向内重复冲洗3次，收集鼻咽部/阴道冲洗液1 500 μl；2 000 ×g离心10 min，收集上清。取1∶50稀释的Tp92蛋白4℃包被96孔酶标板过夜孵育，将冲洗液上清加入反应孔中，37℃孵育1 h，充分洗涤后，加入HRP标记的羊抗兔IgA二抗，37℃再孵育1 h，充分洗涤后加入显色液和终止液。酶标仪读取抗体492 nm波长的A值。无菌采用200目铜网研磨脾脏组织后收获脾细胞，离心弃上清，加裂解液，离心弃上清后稀释计数脾细胞，以100 μl/孔加入到96孔细胞培养板中，每孔细胞数调整为6×105个。用纯化的Tp92蛋白作为刺激抗原（20 μg/ml），同时设ConA（10 μg/ml）刺激孔作为阳性对照，未用抗原刺激细胞孔作为阴性对照。细胞因子ELISA检测试剂盒检测分析细胞培养上清中IL-2、IFN-γ的浓度。

6.MTT法检测兔免疫期间脾细胞增殖：参照方法5制备脾淋巴细胞悬液，稀释至细胞数4×106/ml，以100 μl/孔加入到96孔细胞培养板中，用纯化的Tp92蛋白作为刺激抗原（8 μg/ml），同时设ConA（5 μg/ml）刺激作为阳性对照，未用抗原刺激细胞孔作为阴性对照。置37℃、CO2培养箱中孵育68 h，MTT法检测兔T细胞增殖反应，结果以刺激指数（stimilation index，SI）表示。酶标仪上读取570 nm波长A值，计算SI值（SI=实验组A值/对照组A值）。

7.统计学方法：使用SPSS19.0统计软件。计量资料以±s表示，对6组免疫感染后各时期特异性抗体滴度水平，细胞因子分泌水平及脾细胞SI值等数据资料进行方差分析，兔背部皮肤Tp感染部位皮损Tp检测阳性率和溃烂病灶形成率相关数据采用χ2检验分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、Tp92重组蛋白的表达与鉴定

PET43.1a（+）/Tp92重组质粒扩大培养，于16℃，IPTG终浓度0.2 mmol/L，诱导表达6 h后上清中见特异性表达，结果见图1A。诱导表达的重组蛋白经His标签纯化柱纯化、去内毒素后，分别用His标签抗体（图1B）及梅毒阳性病患血清（图1C）行Western印迹分析，在92 000位置左右有一印迹条带，大小与预期相符。

二、间接ELISA法检测免疫期血清抗Tp92特异性IgG抗体

图 2所示，A2、B1、B2、C1、C2组所诱导的抗Tp92特异性IgG抗体水平在第1次免疫后2、4、6、8周这4个时间点显著高于A1对照组，差异有统计学意义（均P＜ 0.001）；B1组在免疫后4、6、8周抗Tp92特异性IgG抗体水平与B2、A2、C1、C2组比较，差异有统计学意义（均P＜ 0.05）；A2、B2、C1组3组、在免疫后4、6、8周抗Tp92特异性IgG抗体水平，组间两两比较，差异无统计学意义（均P＞0.05）；C2组免疫后4、6、8周抗Tp92特异性IgG抗体水平升高尤为明显，与其他实验组（A2、B1、B2、C1组）比较，差异有统计学意义（均P＜0.05）。

图1 梅毒螺旋体Tp92蛋白的表达及免疫印迹分析鉴定 1A：PET43.1a（+）/Tp92重组质粒在E.coli，BL21的表达：诱导与未诱导表达菌裂解液行12%SDS-PAGE分析；1B、1C：考马斯亮蓝染色：免疫印迹分析纯化重组Tp92蛋白的反应性（1B用His抗体，1C用梅毒阳性血清）

图2 疫苗免疫策略实施组A2、B1、B2、C1、C2组新西兰兔在免疫后不同时间段诱导的特异性Tp92 IgG抗体A值变化（A450 nm）

三、ELISA检测免疫期兔鼻咽部及阴道冲洗液SIgA水平和脾淋巴细胞培养上清IFN-γ、IL-2分泌水平

经免疫后第8周ELISA检测兔脾淋巴细胞培养上清IL-2及IFN-γ分泌水平，A2、B1、B2、C1、C2组高于A1组，差异有统计学意义（均P＜0.001）；B1组IL-2分泌水平与B2、C1组比较，差异无统计学意义（均P＞0.05），与A2、C2组比较，差异有统计学意义（均P＜ 0.05）；而B1组IFN-γ分泌水平与A2、B2、C1、C2组比较，差异有统计学意义（均P＜0.05）；A2组兔IL-2及IFN-γ分泌水平与B2、C1组比较，差异无统计学意义，而与B1、C2组比较，差异有统计学意义（均P＜0.05）；C2组在IL-2及IFN-γ分泌水平在各组中最高，与A2、B1、B2、C1、C2组比较，差异有统计学意义（均P＜0.05）。免疫后第8周，ELISA检测兔鼻咽部及阴道冲洗液SIgA分泌水平，B1、B2、C1、C2组均高于A1组，差异有统计学意义（均P＜0.001），但A2组与A1组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；A2组与B1、B2、C1、C2组比较，差异有统计学意义（均P＜ 0.01）；B1组与B2，C1，C2组比较，差异有统计学意义（均P＜0.01）；B2组与C2组比较，差异有统计学意义（P＜0.001），但与C1组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；C1组与C2组比较，差异有统计学意义（P＜0.001）。见表1。

四、MTT比色法检测新西兰兔免疫后T细胞增殖反应

图3所示，在免疫后第8周，A2、B1、B2、C1、C2组SI均高于A1组，差异有统计学意义（均P＜0.001）；B1组SI与A2、B2、C1、C2组比较，差异有统计学意义（均P＜0.05）；而B2组与A2、C1组比较，差异无统计学意义（均P＞ 0.05），C2组则与A2、B1、B2、C1组感染前SI比较，差异有统计学意义（均P＜0.05）。

五、感染期保护性效果初步评估

1.皮损Tp阳性率及溃疡病灶形成率比较：比较各组兔背部皮肤感染位点Tp阳性率及溃疡病灶形成率发现，A2、B1、B2、C1、C2组均低于A1对照组，差异有统计学意义（均P＜0.001）；A2组与B2、C1、C2组比较，差异有统计学意义（均P＜0.05），但与B1组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；B1组与B2、C1、C2组比较，差异有统计学意义（均P＜0.05）；B2，C1组与C2组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），但B2与C1组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

2.感染早期不同时间节点皮损红肿及溃疡的变化趋势：A1、A2、B1、B2、C1、C2组兔背部皮肤8个位点皮内Tp感染后21 d后，同比观察皮损红肿直径及溃疡病灶形成数，对照组A1感染位点皮损红肿直径最大，溃疡病灶形成数多（图4A）；A2组和B1组皮损红肿直径同比中等大小（图4B，4C）；B2组、C1组及C2组皮损红肿直径同比最小（图4D～4F）。各Tp疫苗接种策略组兔感染位点皮损红肿在第3天左右开始出现（直径3～5 mm），红肿直径达峰值的时间为C2组和B2组21 d（直径9.15和9.62 mm）；A2组16 d和C1组第18天（9.66 mm和10.73 mm）；B1组18 d（11.13 mm）；A1组皮损红肿出现的较晚且较小（第6天，2.5 mm），但红肿增大很快，在第15天达顶峰（为14.44 mm）。皮损红肿完全消退的时间为C2组第44天，A2组47 d，B2组和C1组50 d；B1组56 d；A1对照组在第60天仍保持4 mm，红肿消退晚。

表1 各免疫组兔脾淋巴细胞IL-2及IFN-γ分泌水平及兔鼻咽部及阴道冲洗液SIgA分泌水平比较分析

讨 论

图3 疫苗免疫策略实施组A2、B1、B2、C1、C2组感染前脾细胞刺激指数（SI）比较 各组间单因素方差分析，SI（A1，A2，B1，B2，C1，C2组）：F=68.411，P＜0.001；a：组间两两比较，P ＜0.05

表2 6组兔背部皮肤Tp感染后的皮损Tp阳性率及溃疡病灶形成率比较分析

图4 对照组A1，疫苗免疫策略实施组A2、B1、B2、C1、C2组兔背部皮肤8个位点皮内Tp感染后21 d皮损图 A2、B1、B2、C1、C2组初次免疫后10周，将各实验组15只兔分别用T p.Nichols株进行背部皮内接种，每隔3天观察测量记录皮损红肿及溃疡（红圈示皮损红肿大小）。4A：A1组兔未愈合溃疡；4B：A2组兔中等大红肿；4C：B1组兔中等大红肿；4D：B2组兔最小红肿；4E：C1组兔最小红肿；4F：C2组兔最小红肿

Tp在感染早期主要经泌尿生殖道黏膜侵入机体，机体黏膜局部特异性SIgA对早期抗Tp感染发挥着重要作用。理想的人用梅毒疫苗除了能激发机体全身性的系统免疫外，还必须能有效激发早期黏膜免疫，目前尚无有效的人用梅毒疫苗。疫苗的种类及免疫方式日趋增多，但单一疫苗类型或免疫方式均存在一定缺陷，常规的肌注核酸疫苗通常诱导局部的黏膜免疫水平很低［3，11］，我们前期［3］研究结果也证实这一缺陷，肌注pcD/Tp92免疫兔虽能激发较强的系统免疫应答，但局部黏膜免疫水平很低，未能获得完全保护力。而黏膜免疫模式不但能够诱导局部黏膜免疫，还能诱导加强一定程度的全身系统免疫［12-13］。CpG ODN可被树突细胞和B细胞上Toll样受体9识别，可诱导干扰素γ、趋化因子产生以及诱导Th1免疫应答［14］。因其在黏膜疫苗中作用靶点pDCs是现成的，作为黏膜疫苗佐剂有着良好应用前景。本研究评估了pcD/Tp92疫苗肌注初疫，pcD/Tp92联合佐剂CpG ODN鼻饲加强免疫的接种策略（B2组），结果显示该免疫策略诱生的系统免疫效应较之未联合佐剂CpG ODN免疫策略实施组（B1组）有明显提高，与传统肌注pcD/Tp92免疫法（A2组）差异无统计学意义。因不同类型黏膜表面连接关系，鼻咽部及阴道部黏膜免疫SIgA分泌水平差异无统计学意义，而二者SIgA的水平较之B1和A2免疫策略实施组则有显著升高，且兔背部皮肤感染位点Tp DF阳性率及溃疡病灶形成率均有降低，但皮损愈合的时间（50 d）却较A2组（47 d）长，表明该接种策略可诱导较强特异性黏膜免疫和系统免疫，增强pcD/Tp92核酸疫苗对Tp早期皮肤黏膜感染的免疫保护作用；可能也说明sIgA并非早期抗皮肤黏膜Tp感染的唯一因素，皮损愈合的时间长短不能作为客观反映免疫保护性的指标。

蛋白合成物和多肽免疫原性较弱，加之直接免疫到黏膜位点易失效和黏膜的耐受，常需联合佐剂加强免疫应答［15］。如将CpGODN与蛋白抗原耦合后在免疫过程中能促进蛋白抗原被组织细胞摄入，从而可以降低蛋白抗原疫苗的用量，减少疫苗的免疫次数［10］。因此，本研究评估了pcD/Tp92注初免疫，Tp92重组蛋白联合CpGODN鼻饲加强免疫（C2组）的接种策略，研究显示，此免疫策略诱生兔的系统免疫效应并不比pcD/Tp92肌注免疫2次接种策略（A2组）差，而较pcD/Tp92初次肌注免疫，Tp92重组蛋白加强免疫（C1组）的接种法有显著提高，同时，该接种策略还促进了SIgA的分泌，增强了兔的黏膜免疫，从该组的抗Tp皮肤感染实验皮损病灶DF阳性率（6.67%）及皮损溃疡阳性率（6.67%）结合其皮损病灶愈合时间（44 d），其保护性效果似乎更优于pcD/Tp92核酸疫苗肌内注射加强免疫模式（A2组）和pcD/Tp92疫苗肌注射初免，Tp92重组蛋白抗原鼻饲加强的免疫接种法（C1组）及其他免疫接种策略（B1、B2组）。当然这几项指标尚不能客观准确地反映各实验组疫苗免疫策略的保护性免疫效应，我们将在后续的研究中进一步完善实验数据和指标，更深入地探讨梅毒疫苗的免疫优化策略。

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世界中医药学会联合会第八届中医皮肤科国际学术大会暨2017中国中医药研究促进会皮肤性病学分会学术会议征文通知

由世界中医药学会联合会皮肤科专业委员会和中国中医药研究促进会皮肤性病学分会联合主办，江苏省中医药学会皮肤科分会承办的“世界中医药学会联合会第八届中医皮肤科国际学术大会”和“2017中国中医药研究促进会皮肤性病学分会学术会议”将于2017年8月24-26日在中国南京市举办。

一、征文内容：①中医、中西医结合防治皮肤性病的临床总结、特色疗法、实验研究、文献综述、病例报告、经验体会等；②皮肤科名老中医学术思想、流派的继承及方法学研究；③世界各地中医皮肤科临床实践和发展现状介绍。

二、征文要求：论文内容科学，资料可靠，未在正式出版物发表过。论文文责自负，字数要求中文3 000字以内，并附中英文摘要，以word文档格式发往邮箱 sjzyylhhpfk2009@126.com。

三、截稿日期：2017年7月30日。

联系地址：广州市大德路111号，广东省中医院皮肤科，邮编：510120；联系人：吴元胜、李红毅；联系电话：86-020-81887233-30603。

第十三届全国中医中西医结合皮肤性病研究进展学习班暨2017年广东省中医中西医结合皮肤性病学术会议征文通知

广东省中医药学会皮肤病专业委员会、广东省中西医结合学会皮肤性病专业委员会、广东省中医药学会外治法专业委员会、广东省中医院皮肤科（广州中医药大学第二附属医院皮肤科）联合定于2017年11月23-26日在广州市召开第十三届全国中医中西医结合皮肤性病研究进展学习班暨2017年广东省中医中西医结合皮肤性病学术会议。会议期间同时举办国医大师禤国维学术思想及流派特色技术推广培训班及中医传统特色疗法在皮肤病领域的应用学习班。

征文内容：①中医、中西医结合防治皮肤性病的临床总结、特色疗法、实验研究、文献综述、病例报告、经验体会等；②皮肤科名老中医学术思想、学术流派的继承及方法学研究。

征文要求：论文内容科学，资料可靠，未在正式出版物发表过。论文文责自负，字数要求在中文3000字以内，并附中文摘要，以word文档格式，会议征文发往邮箱lihongyich@126.com，联系人李红毅、陈信生。联系电话：020-81887233-30603。征文截止日期：2017年10月31日。

Optimization of strategies for inoculation of Treponema pallidum pcD/Tp92 DNA vaccine

Liu Anyuan,Tao Lijian,Zhao Tie,Zhao Feijun,Zhang Xiaohong
Xiangya School of Public Health,Central South University,Changsha 410078,China（Liu AY,Tao LJ）;Institute of Pathogenic Biology,University of South China,Hunan Provincial Key Laboratory for Special Pathogens Prevention and Control,Hengyang 421001,China（Zhang XH,Zhao FJ,Zhao T）

Zhang Xiaohong,Email:hengyangzhfj@126.com

ObjectiveTo evaluate immune protective effects ofTreponema pallidum（Tp）pcD/Tp92 DNA vaccine delivered through different inoculation routes against Tp-induced skin infection in New Zealand rabbits.MethodsA total of 108 New Zealand rabbits were randomly and equally divided into 6 groups:A1 and A2 groups treated with intramuscular injection of empty plasmids pcD and pcD/Tp92 DNA vaccine respectively for 2 sessions,B1,B2,C1 and C2 groups firstly treated with intramuscular injection of the pcD/Tp92 DNA vaccine for 1 session for primary immunization,then receiving nasogastric feeding with pcD/Tp92 DNA vaccine,pcD/Tp92 DNA vaccine+cytosine-phosphate-guanine（CpG）oligodeoxynucleotide（ODN）,and recombinant Tp92 protein,and recombinant Tp92 protein+CpG ODN respectively for booster immunization.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was conducted to detect the serum level of anti-Tp92 IgG antibody at week 0,2,4,6,8 after immunization,the SIgA level in the nasopharyngeal region and vaginal mucosa at week 8 after immunization,as well as levels of interleukin-2（IL-2）and interferon-γ（IFN-γ）in the culture supernatant of rabbit spleen cells at week 8 after immunization,and methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay was performed to estimate proliferative activity of rabbit splenic lymphocytes in three rabbits from each group.At week 10 after immunization,other 15 rabbits from each group were subcutaneously inoculated with Tp standard strain,and changes of skin lesions at the inoculation site during early-stage infection were observed and recorded.ResultsAt week 8 after immunization,the C2 group showed significantly higher serum level of anti-Tp92 IgG antibody（1.825 ± 0.175）,supernatant levels of IL-2（154.7 ± 14.6）and IFN-γ（277.4 ± 24.4）,and proliferative activity of T cells（3.57 ± 0.24）compared with the A2（1.372±0.322,112.3±13.4,232.8±25.3,3.08±0.22,respectively,allP＜0.05）,B1（0.893±0.297,76.6±21.5,165.7±22.6,2.12±0.14,respectively,allP＜0.05）and B2（1.294±0.124,97.3±18.7,211.3±24.6,2.88±0.18,respectively,allP＜0.05）groups.In addition,effective immunoprotection was achieved in the C2 group with more production of mucosa-specific SIgA antibody,as well as the lowest Tp-positive rate（6.67%）and ulcer formation rate（6.67%）in skin lesions at the inoculation sites.ConclusionThe effective vaccination strategy,namely intramuscular injection of the pcD/Tp92 DNA vaccine for primary immunization followed by nasogastric feeding with mucosal adjuvant CpG ODN combined with recombinant Tp92 protein for booster immunization,can induce the strongest mucosal immune responses and immune protective effects.

Syphilis;Treponema pallidum;Vaccines;DNA;Immunity;Mucous membrane;Rabbits;Tp92;CpG-ODN

张晓红，Email：hengyangzhfj@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2017.05.004

国家自然科学基金（81373230、81301470）

2016-11-15）

（本文编辑：吴晓初）