普萘洛尔抗焦虑作用与脑内四氢孕酮相关性研究

丘秀玉，曾 洁，蒋 群，张玲玲

（广州医科大学附属第五医院，广东 广州 510700）

普萘洛尔抗焦虑作用与脑内四氢孕酮相关性研究

丘秀玉，曾 洁，蒋 群，张玲玲

（广州医科大学附属第五医院，广东 广州 510700）

目的探讨普萘洛尔抗焦虑效应的作用机制。方法选用昆明小鼠50只，单次腹腔注射左旋－丁硫氨酸－亚砜亚胺（BSO）5 mg／kg建立焦虑症动物模型，并按用药的不同分为模型组（不额外用药），普萘洛尔低剂量组（10 mg／kg）、中剂量组（20 mg／kg）、高剂量组（40 mg／kg）及舍曲林阳性药组（10 mg／kg），各10只。另取10只小鼠作为正常对照组。各组小鼠给予相应剂量药物，药物质量浓度均为100 g／mL，正常对照组给予等体积的溶剂（生理盐水），每天1次，连续灌胃7 d后开始抗焦虑药效学评价。选用经典焦虑模型试验（Vogel饮水冲突试验、高架十字迷宫试验和明暗箱穿梭试验）评价普萘洛尔的抗焦虑作用；采用酶联免疫吸附试验测定法（ELISA）分别检测小鼠前额皮质和海马四氢孕酮的水平和血清皮质酮的浓度。行为学评价期间，每天给药1 h后再进行试验。结果Vogle饮水冲突试验中，普萘洛尔连续给药显著性增加焦虑症小鼠饮水次数；高架十字迷宫试验中，普萘洛尔中、高剂量（20，40 mg／kg）显著性增加焦虑症小鼠在开臂的停留时间百分比和开臂次数百分比；明暗穿梭箱试验中，普萘洛尔中、高剂量明显增加焦虑症小鼠明暗箱的穿梭次数及明箱的停留时间百分比；ELISA检测结果显示，与正常对照组比较，BSO注射小鼠海前额皮质和海马的四氢孕酮含量显著减少而血清皮质酮浓度明显升高，普萘洛尔各剂量均能不同程度逆转BSO引起的变化。结论普萘洛尔改善小鼠焦虑样行为与脑内前额皮质和海马的四氢孕酮有关，其可能通过升高前额皮质和海马四氢孕酮的水平，进而抑制血清皮质酮的分泌。

普萘洛尔；抗焦虑；四氢孕酮；皮质酮；小鼠

焦虑症是以发作性或持续性情绪焦虑和紧张为主要临床表现的神经症，发病机制至今尚未完全明确[1]。γ－氨基丁酸 （γ－amino－butylic acid，GABA）是中枢神经系统中重要的抑制性神经递质，可介导30%～40%神经元的传导功能，在焦虑症的发作中起重要作用[2]。GABAA受体的调控结合位点包括苯二氮 类药物、神经类固醇、巴比妥类和印防己毒素5个结合位点[3]。作为GABAA受体调节剂的苯二氮 类抗焦虑药物已临床应用数十年。然而，由于GABAA受体苯二氮 结合位点分布较广，影响机体多种生理功能，其激动剂尽管有明显的抗焦虑作用，但也表现出镇静、肌肉松弛、运动不协调等不良反应，在一定程度上限制了该位点调节药物的临床前景[4]。因此，研究者开始将目光投向GABAA受体的其他结合点。近年来，以四氢孕酮为代表的神经类固醇激素逐渐成为挖掘抗焦虑药物的关注点[5]。普萘洛尔为非选择性β肾上腺素能受体阻滞剂，广泛用于治疗心血管疾病，新近研究提示其具有潜在的抗焦虑作用，尤其适用于对苯二氮 类药物有成瘾或耐受的患者[6]。然而，针对普萘洛尔治疗焦虑症的药效作用机理研究一直处于空白。因此，本研究中拟采用小鼠焦虑症模型，探讨普萘洛尔发挥抗焦虑作用是否与四氢孕酮有关，为该药防治焦虑症提供实验室依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物与试药

动物：健康雄性成年昆明小鼠60只，SPF级，体质量（20±2）g，购自广东省实验动物中心，动物合格证号为SCXK（粤）2014－00114。所有小鼠正常饲养，自由饮水进食，饲养温度24～26℃，相对湿度40% ～60%。

试药：普萘洛尔（纯度 ＞99%），舍曲林 （纯度＞98%），左旋－丁硫氨酸－亚砜亚胺[L－bu－thionine－（S，R）－sulfoximine，BSO]，均为美国 Sigma－Aldrich 公司产品；水合氯醛（天津科密欧化学试剂有限公司）；四氢孕酮、皮质酮酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒（上海生物工程股份有限公司）。

1.2 方法

分组与给药方法：将50只小鼠腹腔注射BSO（5 mg／kg）建立焦虑动物模型，并按用药的不同分为模型组（不额外用药），普萘洛尔低剂量组（10 mg ／kg）、中剂量组（20 mg ／kg）、高剂量组（40 mg ／kg）及舍曲林阳性药组（10 mg／kg），各10只。另取10只小鼠作为正常对照组。各组小鼠给予相应剂量药物，药物质量浓度均为100 g／mL，正常对照组给予等体积的溶剂（生理盐水），每天1次，连续灌胃7 d后开始抗焦虑药效学评价。行为学评价期间，每天给药1 h后再进行试验。

Vogel饮水冲突试验：小鼠禁水48 h后单独放置于试验箱，当小鼠在试验箱内饮水20次后，控制仪自动开始计时3 min。当小鼠饮水20次，对其进行足底电击1 次（0.30 mA，2 s），仪器自动记录 3 min 内小鼠被电击和主动饮水的次数。

高架十字迷宫试验：将小鼠按头朝开臂的方向置于十字迷宫中央，高架的高度不超过30 cm，观察者与迷宫至少保持1 m的距离，摄像机记录5 min内小鼠在开臂和闭臂内的停留时间和进入次数。分别以小鼠在开臂的停留时间、进入开臂的次数除以开闭臂停留总时间、进入开闭臂总次数计算百分率。

明暗箱穿梭试验：小鼠置于明暗箱中自由活动5 min，然后将小鼠背对暗室置于明室中央观察记录10 min内小鼠在明暗箱的穿梭次数和明箱内停留时间，以此作为评价药物抗焦虑作用的指标。整个试验过程中注意保持实验环境的安静和实验装置的清洁，以减少外界环境对试验结果的影响。

检测方法：试验结束后，于小鼠腹主动脉采血、离心收集血浆。另外快速分离脑组织，分别提取小鼠皮层、海马蛋白进行ELISA检测。组织按质量体积比1∶5加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂）冰上超声匀浆后，在4℃下以 12 000 r／min的速率离心 10 min，收集上清液。根据ELISA试剂盒步骤测定组织中四氢孕酮及血清皮质酮水平。

1.3 统计学处理

采用SPSS 18.0统计学软件分析，各指标采用单因素方差分析，并采用 LSD－t分析方法进行组间两两比较，结果以均数±标准差表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Vogel饮水冲突试验

与正常对照组比较，模型组小鼠饮水次数明显减少，而普萘洛尔不同剂量小鼠的饮水次数呈剂量依赖性地增加，其中中、高剂量组（20，40 mg ／kg）的作用与模型组比较，差异有统计学意义（P ＜0.05，P ＜0.01）。详见表1，提示普萘洛尔有一定的抗焦虑效应。

表1 Vogel饮水冲突试验结果次，n＝10）

表1 Vogel饮水冲突试验结果次，n＝10）

注：与正常对照组比较，＃P ＜0.01；与模型组比较， P ＜0.05，P ＜0.01。表 2，表 4 同。

组别正常对照组模型组舍曲林组 （5 mg ／kg）普萘洛尔 低剂量组 （10 mg／kg）中剂量组 （20 mg ／kg）高剂量组 （40 mg ／kg）饮水次数93.51 ± 5.27 64.23 ± 2.96＃92.92 ± 4.08 72.44 ± 3.45 82.92 ± 4.11 90.28 ± 2.96

2.2 高架十字迷宫试验

普萘洛尔在不影响入臂总次数和总时间（P＞0.05）的前提下，可较模型组显著增加小鼠开臂停留时间百分率（20 mg／kg，P ＜0.05；40 mg／kg，P ＜0.01） 和进入开臂次数的百分率（20 mg／kg，P ＜0.05；40 mg／kg，P ＜0.01）。详见表2。进一步表明，普萘洛尔有明显的抗焦虑作用。

2.3 明暗箱穿梭试验

与正常对照组相比，模型组小鼠在明暗箱中穿梭次数及在明箱内停留时间比减少（P＜0.01），经普萘洛尔给药后，两指标数据均有所增加，其中中剂量组、高剂量组与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。详见表3。表明普萘洛尔不仅有抗焦虑效应，且药效有一定的剂量依赖性。

表2 高架十字迷宫试验结果%，n＝10）

表2 高架十字迷宫试验结果%，n＝10）

组别正常对照组模型组舍曲林组 （5 mg ／kg）普萘洛尔 低剂量组 （10 mg／kg）中剂量组 （20 mg ／kg）高剂量组 （40 mg ／kg）开臂次数27.39 ± 4.01 13.96 ± 2.96＃26.26 ± 3.56 16.20 ± 1.75 24.06 ± 3.27 27.70 ± 5.62开臂停留时间比21.33 ± 2.64 9.32 ± 1.47＃19.33 ± 1.36 13.37 ± 1.48 17.34 ± 2.44 20.19 ± 2.53

表3 明暗箱穿梭试验结果（n＝10）

表3 明暗箱穿梭试验结果（n＝10）

注：与正常对照组比较，＃P ＜0.01；与模型组比较， P ＜0.01。表5同。

组别正常对照组模型组舍曲林组 （5 mg ／kg）普萘洛尔 低剂量组（10 mg／kg）中剂量组 （20 mg ／kg）高剂量组 （40 mg ／kg）穿梭次数（次）41.50 ± 5.27 18.20 ± 2.96＃39.90 ± 4.08 20.40 ± 3.45 27.90 ± 4.11 37.20 ± 2.96明箱停留时间比（%）34.70 ± 3.86 20.20 ± 4.32＃30.10 ± 3.12 24.70 ± 3.34 26.00 ± 3.52 29.10 ± 3.28

2.4 对小鼠前额皮质和海马脑区四氢孕酮水平的影响

与正常对照组比较，模型组前额皮质及海马脑区的四氢孕酮含量出现显著减少（P＜0.01），普萘洛尔和阳性对照药舍曲林均能明显增加小鼠前额皮质和海马脑区四氢孕酮水平，其中普萘洛尔中、高剂量组与模型组比较，差异有统计学意义（20 mg／kg，P ＜ 0.05；40 mg／kg，P ＜0.01）。详见表 4（为方便起见，每组仅任选6只小鼠进行检测。表5同）。表明普萘洛尔发挥抗焦虑作用可能与增加大脑前额皮质和海马四氢孕酮水平有关。

表4 普萘洛尔对小鼠前额皮质和海马脑区四氢孕酮水平的影响（，pg／mL，n＝6）

表4 普萘洛尔对小鼠前额皮质和海马脑区四氢孕酮水平的影响（，pg／mL，n＝6）

组别 四氢孕酮正常对照组模型组舍曲林组 （5 mg ／kg）普萘洛尔 低剂量组（10 mg／kg）中剂量组（20 mg ／kg）高剂量组（40 mg ／kg）前额皮质273.22 ± 7.48 178.26 ± 9.80＃220.51 ± 8.53 184.82 ± 9.51 195.82 ± 9.31 210.91 ± 8.32海马332.27 ± 11.60 128.91 ± 19.88＃289.32 ± 11.23 133.46 ± 15.46 168.05 ± 13.73 220.31 ± 12.69

2.5 对小鼠血浆中皮质酮水平的影响

与正常对照组相比，模型组血清皮质酮的水平明显增高，各剂量普萘洛尔和阳性药舍曲林均明显降低小鼠血浆中皮质酮水平，其中普萘洛尔中、高剂量组与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。详见表5。提示普萘洛尔可能对应激引起的皮质酮水平增高有调节作用。

表5 普萘洛尔对小鼠血浆中皮质酮水平的影响（，pmol／L，n＝6）

表5 普萘洛尔对小鼠血浆中皮质酮水平的影响（，pmol／L，n＝6）

组别正常对照组模型组舍曲林组（5 mg ／kg）普萘洛尔 低剂量组（10 mg／kg）中剂量组（20 mg ／kg）高剂量组（40 mg ／kg）血清皮质酮80.81 ± 10.72 129.25 ± 9.16＃82.32 ± 8.83 119.10 ± 13.80 99.39 ± 9.75 854.30 ± 10.72

3 讨论

焦虑是神经官能症的常见症状，以往多以苯二氮类药物治疗。由于该类药物不良反应较多，寻求安全性高的有效替代药物一直是临床迫切的需求。应激反应引起的焦虑往往伴有交感神经系统的激活，而交感神经的激活反应则受到β肾上腺素受体的调节[7]。β－受体阻滞剂能减轻或降低应激性心动过速、心律失常和血浆脂肪酸的升高，对社交场合所产生的紧张和主观焦虑不适均有一定的缓解作用。然而针对该类药（如普萘洛尔）的基础性研究并不多，其如何发挥焦虑效应的机理也不明确。因此，本研究中采用BSO注射建立小鼠焦虑模型，对普萘洛尔进行药效学基础评价并观察其对四氢孕酮及皮质酮的作用，结果证实，普萘洛尔改善小鼠的焦虑样行为可能与调节脑内四氢孕酮和血浆皮质酮水平有关。

本研究中采用的焦虑评价方法中，Vogel饮水冲突试验是基于条件反射原理构建的，将饮水和不确定电击关联，让小鼠在饮水和避免电击冲突之间做出选择，以评价小鼠的焦虑样症状[8]；高架十字迷宫则是属于非条件反射模型，以小鼠自发恐惧反应为行为基础，让小鼠暴露于开放性和封闭性场合，以观察小鼠的焦虑样行为[9]；明暗箱穿梭试验是以明箱中的亮光作为刺激源，由于小鼠本身趋暗的习性，当其被置于明箱中则会表现出焦虑样症状，故其在明暗箱中穿梭次数及明箱停留时间被作为评价抗焦虑的重要指标[10]。以上3个模型均为国际公认的评价焦虑反应的方法，被广泛应用于大、小鼠等啮齿类动物。本研究结果表明，普萘洛尔能增加小鼠的饮水次数、在开臂停留的时间和次数以及明暗箱穿梭次数、明箱停留时间百分比，具备明确的抗焦虑药理效应。

研究表明，在小鼠明暗箱穿梭和高架十字迷宫焦虑模型试验中，神经类固醇激素具有明确的抗焦虑行为学作用，而四氢孕酮发挥着决定性作用；将四氢孕酮直接注入大脑相关脑区，小鼠进入开臂次数和时间百分比明显增多。与苯二氮 类药物相比，四氢孕酮发挥抗焦虑效应，并不影响小鼠的自主活动，有可能是神经类固醇激素治疗焦虑症疾病的潜在关注点[11]。应激主要与下丘脑－垂体－肾上腺（HPA）轴有关，焦虑会导致血浆皮质酮水平迅速升高，进而引起机体的各种损伤。四氢孕酮具有负性调节HPA轴的作用，可通过一系列的下游信号转导通路影响皮质酮的水平[12]。本研究结果也证实，普萘洛尔对能增加脑内四氢孕酮的水平，进而降低血浆皮质酮的水平而产生抗焦虑作用。尽管如此，普萘洛尔介导的四氢孕酮水平升高如何影响皮质酮还有待进一步阐明。

综上所述，普萘洛尔作为心血管疾病治疗的一线药物，其抗焦虑药理作用明确，可作为替代药物，用于对苯二氮 类药物有高度依赖危险性患者，且毒性小，安全性较高，值得临床推广。

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Correlation Study Between Anxiolytic Effect of Propranolol and Allopregnanolone in Brain

Qiu Xiuyu，Zeng Jie，Jiang Qun，Zhang Lingling
（The Fifth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou，Guangdong，China 510700）

Objective To investigate the mechanism of anxiolytic effect of propranolol.Methods Totally 50 Kunming mice were given single intraperitoneal injection of 5 mg ／kg BSO for establishing anxiety animal models，and they were divided into model group （no additional medication），propranolol low－ dose group （10 mg ／kg），medium dose group （20 mg ／kg），high dose group （40 mg ／kg） and sertraline positive drug group （10 mg ／kg），10 cases in each group.Another 10 mice were selected as normal control group.Each group of mice was given the corresponding dose of medicine，the normal control group was given equal volume of solvent （physiological saline），1 time a day，after continuous intragastric administration of 7 d，the anti anxiety pharmacodynamics was evaluated.The anxiolytic effects of propranolol were evaluated by the classic anxiety model test （Vogel′s conflict test，elevated plus maze test and light－ dark box test）.The level of allopregnanolone and concentration of serum corticosterone in the prefrontal cortex and hippocampus of mice were detected by ELISA.During the behavioral evaluation，the test was done after the medication of 1 h every day.Results Vogel′s conflict test showed that continuous administration of propranolol could significantly increase the number of drinking water in anxiety mice.Elevated plus maze test showed that the median and high doses of propranolol （20，40 mg ／kg） significantly increased the anxiety mice′s percentage of residence time and the number of open arm entering.In light－ dark box test，median and high dose of propranolol significantly increased the anxiety mice′s percentage of residence time in the light box and the shuttle number in light－ dark box.In the ELISA test，compared with the normal control group，the level of allopregnanolone in the prefrontal cortex and hippocampus of mice injected with BSO were significantly decreased，while the concentration of serum corticosterone was significantly increased.Each dose of propranolol can reverse the change induced by BSO in different degrees.Conclusion The effect of propranolol on anxiety－ like behavior in mice is related to allopregnanolone in the prefrontal cortex and hippocampus of the brain，which may increase the level of allopregnanolone in prefrontal cortex and hippocampus and then inhibit the secretion of corticosterone in serum.

propranolol；antianxiety；allopregnanolone；corticosterone；mice

R965.2；R971

A

1006－4931(2017)20－0034－04

10.3969 ／j.issn.1006 － 4931.2017.20.009

丘秀玉（1984 － ），女，大学本科，研究方向为精神药理学，（电话）020 － 82288145（电子信箱）437496216＠ qq.com。

2017－06－06)