响应面法优化徐长卿中丹皮酚提取工艺研究

郭伊霖，宗时宇，浦益琼，徐本亮，王 冰

（上海中医药大学，上海 201203）

响应面法优化徐长卿中丹皮酚提取工艺研究

郭伊霖，宗时宇，浦益琼，徐本亮，王 冰

（上海中医药大学，上海 201203）

目的利用响应面法优选徐长卿中丹皮酚的最佳提取工艺。方法采用水蒸气蒸馏法提取徐长卿中丹皮酚，采用响应面法优选提取工艺，以浸泡时间（A）、液料比（B）、氯化钠量（C）为自变量，以归一值(OY值，Y）为因变量，分别进行多元线性方程回归和二次多项式方程拟合，优选最佳提取工艺并进行验证。结果最佳提取工艺为浸泡时间3 h，料液比1∶15，氯化钠量150 g／kg。结论该优选工艺可用于徐长卿中丹皮酚的提取，方法简便、稳定、可行。

响应面法；水蒸气蒸馏法；徐长卿；丹皮酚；提取工艺

中药徐长卿为萝摩科植物徐长卿 Cynanchum paniculatum（Bge.） Kitag.的干燥根和根茎，性温，味辛，具祛风化湿、止痛止痒、温经通络、活血解毒、利水消肿之功效，常用于治疗风湿痹痛、胃痛牙痛、跌打损伤、湿疹、荨麻疹等症[1]。徐长卿药材中挥发油含量较高，其中丹皮酚的含量高达94.7%，是主要活性成分[2]。丹皮酚具有显著的抗炎、抗变态反应作用，对脾脏、胸腺等免疫器官及淋巴细胞、单核细胞等免疫分子均有显著调节作用[3]。尽管丹皮酚可化学合成，但市售的丹皮酚提取物多来源于徐长卿、牡丹皮等中药材，制得的丹皮酚不仅纯度高而且安全性好[4]。因此，需进一步改进其提取工艺，以更好地满足临床需求。

丹皮酚是小分子酚类化合物，熔点低，易挥发，水溶性差。徐长卿中丹皮酚的提取方法主要有水蒸气蒸馏法、超声波辅助提取法、CO2超临界流体萃取法及溶剂浸润提取法等[5]。其中，溶剂浸润提取法耗费溶剂且提取物纯度低，CO2超临界流体萃取法的设备投资成本高，超声波辅助提取法尚未完善中试放大工艺，而水蒸气蒸馏法则不需要特殊仪器，既适用于小型实验室制备，又方便投入大生产，最重要的是可直接获得丹皮酚晶体，且晶体纯度较高，整体成本非常低[6]。因此，本研究中拟选用水蒸气蒸馏提取法，利用响应面分析法优选徐长卿中丹皮酚的最佳提取工艺。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱系统（安捷伦科技公司）；DZF－6050型真空干燥箱（上海博讯实业有限公司）；KH－400KDB型高功率数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；TGL－20B型高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；XS105DU型电子分析天平（瑞士梅特勒－托利多公司）；BS124S型电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；电热套（江苏近湖镇教学仪器厂）；蒸馏装置（上海青阳生物科技有限公司）。

1.2 试药

丹皮酚对照品（批号为110708－201407，中国食品药品检定研究院）；甲醇（色谱纯，安徽时联特种溶剂股份有限公司）；试验用水为纯净水（杭州娃哈哈百立食品有限公司）；氯化钠（分析纯，批号为 20160428，国药集团化学试剂有限公司）；其他试剂均为分析纯。徐长卿饮片（批号为150613）购自上海康桥中药饮片有限公司，经上海中医药大学张红梅博士鉴定为徐长卿Cynanchum paniculatum（Bge.） Kitag.。

2 方法与结果

2.1 含量测定方法建立

2.1.1 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：Ultimate® XB －C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇 － 水（65 ∶35），流速：1.0 mL ／min；检测波长：274 nm；柱温：25℃。理论板数按丹皮酚峰计算应不低于5 000。

2.1.2 溶液制备

对照品贮备液：称取丹皮酚对照品10.38 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容，摇匀，制得质量浓度为207.6 μg／mL的对照品贮备液，于4℃保存。

供试品溶液：称取丹皮酚结晶，精密称定，用甲醇溶解稀释至一定质量浓度，0.45μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 方法学考察

专属性试验：精密称取一定量丹皮酚结晶，按2.2项下方法制备供试品溶液。分别取空白甲醇溶液、供试品溶液及对照品溶液，按2.1项下色谱条件进样，利用高效液相色谱（HPLC）系统测定。结果空白甲醇对丹皮酚的测定无干扰。结果见图1。

线性关系考察：取对照品贮备液，用甲醇逐级稀释成 质 量 浓 度 为 5.19， 10.38， 20.76， 41.52， 83.04，166.08 μg／mL 的系列溶液，摇匀，作为对照品溶液。精密吸取上述对照品溶液各10 μL，分别注入HPLC仪，记录峰面积，以质量浓度（X，μg／mL)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线(见图2)，回归方程 Y＝51.763 X＋14.162，r＝1.000(n＝6)。结果表明，丹皮酚质量浓度在5.19～166.08μg／mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取质量浓度为 5.19，41.52，166.08 μg／mL 的对照品溶液，按 2.1 项下色谱条件，1 d内连续重复进样6次，连续测定3 d，记录峰面积。结果低、中、高质量浓度对照品溶液色谱日内精密度的RSD 依次为 0.53% ，0.20% 和 0.31% ，日间精密度的RSD 依次为 2.80% ，0.87% 和 0.47% ，RSD 均小于3.00%，表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批样品，依法平行制备6份供试品溶液，进样测定。结果的 RSD为2.30%(n＝6)，表明方法重复性良好。

稳定性试验：精密吸取同一供试品溶液，分别于室温放置 0，2，4，6，8，12，24 h 时进样测定。结果峰面积的RSD为1.10%(n＝7)，表明供试品溶液在24 h内稳定。

加样回收试验：精密称取适量已知纯度（94.10%）的丹皮酚结晶，平行9份，每3份为1组，分低、中、高浓度3组，分别加入相当于样品含量的50%，100%，150%的丹皮酚对照品溶液，用甲醇溶解稀释至线性范围，按2.1项下色谱条件测定丹皮酚的含量，并计算低、中、高3种质量浓度的加样回收率。结果见表1。

图1 高效液相色谱图

2.2 徐长卿中丹皮酚含量测定

按照 2015年版《中国药典（一部）》方法，称取约0.5 g徐长卿饮片粗粉，置100 mL具塞锥形瓶中，平行取3份，分别精密加入50 mL甲醇，称定质量，超声处理（功率 250 W，频率 40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取1 mL续滤液，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。以2.1项下色谱条件测定徐长卿饮片中丹皮酚的含量。结果显示，该批徐长卿中丹皮酚含量为1.68%（RSD ＝1.90%），符合药典规定。

2.3 提取工艺考察

2.3.1 提取工艺

称取约40 g徐长卿粗粉，置1 000 mL圆底烧瓶中，加入一定量的蒸馏水和氯化钠浸润一定时间后，进行水蒸气蒸馏，至再无浑浊馏出液滴出时停止蒸馏，将馏出液重蒸馏，收集馏出液于4℃冷藏、静置48 h后，抽滤收集结晶，25℃干燥称重，即得丹皮酚结晶[7]。

表1 加样回收试验结果（n＝9）

2.3.2 响应面法优化提取工艺

采用Box－Benhnken设计BBD－响应面法，以丹皮酚纯度（Y1）和丹皮酚得率（Y2）为指标，料液比、浸泡时间、NaCl加入量为影响因素，使用 Design Expert 8.0.6软件设计试验方案及对结果进行分析，优化筛选丹皮酚的最佳提取工艺。因纯度与得率均是越高越好，故本试验中采用总评“归一值（OY）”法进行综合考察。因素与水平见表2。

表2 响应面设计因素水平表

利用软件 Design Expert 8.0.6[8－10]设计出 17 组试验，其中包括12个析因点试验和5个用于估计试验误差的中央点重复试验。结果显示，丹皮酚的得率为0.74% ～ 1.06% ，且纯度均高于 90.00% ，最高可达98.39%。具体试验设计及结果见表3。

对OY值[OY＝（Y1／Y1max）×0.9＋（Y2／Y2max）×0.1]，进行多元线性方程回归和二次多项方程拟合，得响应值OY对自变量的二次多项回归方程：

绘制上述拟合回归方程的三维效应面和二维等高图，见图2。优选出丹皮酚提取的最佳工艺为料液比1∶15，NaCl量 6 g（150 g ／kg），浸泡时间 3 h。由于每个因素只有3个水平，因此选择BBD－响应面法较星点设计CCD－响应面法更经济、高效，减少试验次数的同时，又保证了试验精度[11]。

表3 响应面分析方案及试验结果

2.4 最优提取工艺条件验证

以选出的最佳提取工艺，分别进行3组平行验证试验。结果见表4。实测值与预测值偏差较小，说明建立的模拟回归方程预测性较好，其所优选出的最佳提取工艺重复性良好（RSD＜3.00%），该工艺所获得的结晶纯度可达95.60%，说明提取获得的丹皮酚纯度较高。

表4 预测值与实际值的比较

3 讨论

响应面法是采用非线性数学模型进行拟合，用三维效应面进行优化来预测最佳试验条件，精度高、预测性好、简便，解决了正交试验设计只能对孤立的试验点进行分析，无法找出整个区域的最佳组合缺点[12]。本研究中采用BBD－响应面分析法，建立模拟回归方程，并绘制响应值 OY对自变量的效应面，从而成功优选出徐长卿中丹皮酚的最佳提取工艺：料液比为1∶15，NaCl量为150 g／kg，浸泡时间为3 h。该工艺不仅稳定可行，且获得的丹皮酚结晶纯度高（95.60%），可为后期的制剂研究及药效评价提供高纯度样品制备方法，及为课题后续开展提供试验依据。

图2 各因素间的响应面图和等高线图

[1]江苏新医学院.中药大辞典[M].上海：上海科学技术出版社，2000：1894 － 1895.

[2]付 明，王登宇，胡 兴，等.徐长卿化学成分研究 [J].中药材，2015，38（1）：97 － 100.

[3]朱 娜，李见春，张文静，等.徐长卿药材中丹皮酚超声提取工艺研究[J].亚太传统医药，2015，11（2）：37 － 38.

[4]江书庆，信建豪.牡丹皮中丹皮酚水蒸汽提取研究[J].亚太传统医药，2014，10（1）：28 － 29.

[5]耿 帅，赵育林，曾 凯，等.丹皮酚的研究进展[J].中国新药与临床杂志，2016，35（5）：310 － 313.

[6]翟科峰，段 红，曹稳根，等.响应面法优化徐长卿中丹皮酚的提取工艺[J].宿州学院学报，2016，31（4）：122 －126.

[7]Cai H，Qin KM，Liu X，et al.Current research status and relevant thoughts on quality standardization of Chinese herbak pieces[J].World Sci Tech Mod Tradit Chin Med，2011，13（3）：450 － 456.

[8]Guo JH， Zhang K，Zhang TJ，et al.Optimum technology of homogenated extraction for fresh rehmannia by central composite design － response surface methodology[J].Chin J Mod Appl Pharm，2015，32（2）：148 － 152.

[9]Dong XX，Fu J，Yin XB，et al.Study of paeonol extraction process and inclusion process from Cortex Moutan[J].World J Integr Trad West Med，2015，10（1）：37 － 39.

[10]You QH，Yin XL.Optimization of extraction of phellinus igniarius polysaccharides using response surface methodology[J].China Brewing，2010，29（5）：67 － 69.

[11]余小翠，刘高峰.响应面分析法在中药提取和制备工艺中的应用[J].中药材，2010，33（10）：1651 － 1655.

[12]施 昶，沈诗思，黄海飞，等.星点设计－效应面优化法在处方筛选和优化中的应用[J].机电信息，2014（32）：41 －46.

Optimization of Extraction Process of Paeonol in Cynanchum Paniculatum by Response Surface Method

Guo Yilin，Zong Shiyu，Pu Yiqiong，Xu Benliang，Wang Bing
（ Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai， China 201203）

Objective To optimize the extraction process of paeonol in Cynanchum paniculatum by response surface method（RSM）.Methods The paeonol was extracted in Cynanchum paniculatum by steam distillation.The extraction process was optimized by RSM，the effect of extraction time （A），ratio of liquid to material （B） and amount of sodium chloride （C） as the independent variable，OY Value（Y） as the dependent variable，the multiple linear equation regression and the quadratic polynomial equation fitting were carried out respectively，and the optimal extraction process was selected and validated.Results The optimal extraction conditions were as follows：immersion time was 3 h，ratio of material to liquid was 1 ∶15，and sodium chloride was 150 g ／kg.Conclusion The optimization process can be used to extract paeonol in Cynanchum paniculatum，the method is simple，stable and feasible.

response surface method；steam distillation； Cynanchum paniculatum；paeonol；extraction process

TQ460.6；R284.1

A

1006－4931(2017)20－0009－04

10.3969 ／j.issn.1006 － 4931.2017.20.003

上海市教育委员会预算内科研项目[2014YSN28]。

郭伊霖，在读硕士研究生，研究方向为中药学，（电话）021－51322352（电子信箱）gyl101010＠126.com。

王冰，博士研究生，副教授，研究方向为中药纳米给药系统，（电话）021－51323123（电子信箱）annabel＿cn＠163.com。

2017－06－06)