开心解郁方对抑郁模型大鼠行为学与血清炎性细胞因子的影响＊

马 丽，张 颖，潘菊华，王彦云，孙梦云，黄世敬

（中国中医科学院广安门医院 北京 100053）

开心解郁方对抑郁模型大鼠行为学与血清炎性细胞因子的影响＊

马 丽，张 颖，潘菊华，王彦云，孙梦云，黄世敬＊＊

（中国中医科学院广安门医院 北京 100053）

目的：探讨开心解郁方对抑郁模型大鼠抑郁行为及其外周炎性细胞因子表达水平的影响。方法：选用SD雄性大鼠，根据糖水偏好与体重分为正常组、模型组、中药组，采用慢性不可预知温和应激联合孤养6周的方法建立大鼠抑郁症模型，记录体重，行糖水偏好、强迫游泳试验评价大鼠的抑郁状态，通过酶联免疫吸附法检测大鼠血清中白细胞介素（IL）-1β、IL-2、IL-6、肿瘤坏死因子（TNF）-α浓度变化。结果：与正常组比较，模型组大鼠体重、糖水偏好与饮水总量显著降低，强迫游泳不动时显著延长，血清IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α表达水平显著升高；中药组大鼠体重与模型组比较无差异，糖水偏好与饮水总量显著升高，不动时间缩短，血清IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α表达水平显著降低。结论：开心解郁方能改善抑郁症模型大鼠的抑郁症状，可能与其调节血清炎性细胞因子的表达水平相关。

开心解郁方 抑郁症 炎性细胞因子 慢性不可预知温和应激行为学

抑郁症是以心境低落、兴趣减退为主要症状，伴见内疚、低自我价值感、失眠或睡眠过多、食欲或体重的异常、注意力不集中、疲劳等认知和躯体的变化，影响患者工作、学习、生活及社会功能，严重者可以导致自杀，存在高患病率、高复发率、高自杀风险，低识别率和低治疗率的[1]诊疗特点。根据世界卫生组织的最新报道，目前中国大概有5 400万的抑郁症患者，全球3亿多人罹患抑郁症，约占全球人口的4.3%，从2005年至2015年，近十年来增速约18%，导致的经济损失超过一万亿美元[2]。抑郁症主要依靠心理和药物治疗，只有30%到35%的成年人通过目前的治疗方法达到缓解，许多患者从来没有接受过诊断或治疗[3]，药物干预产生的不利影响会使患者早期终止服药[4]，1/3的患者对抗抑郁药有耐药性[5]，对抗抑郁药治疗反映较好的患者存在相当比例的残留症状，常见的如睡眠障碍、食欲减退、疲乏等[6]。开心解郁方是在中医理论与临床实践指导下，经临床验证抗抑郁疗效肯定的经验方，在与氢溴酸西酞普兰、氟西汀的临床对照研究中，其临床疗效与西酞普兰、氟西汀相当，对中医症状的缓解优于西酞普兰、氟西汀，特别是对“善太息”、“乏力”、“失眠”、“不思饮食”症状改善显著优于西酞普兰、氟西汀[7-8]，这体现了开心解郁方治疗抑郁症的优越性。免疫炎症机制是抑郁症的多种机制之一[9]，文献报道，抑郁症患者与抑郁症模型动物，存在免疫炎症的失衡，外周炎性因子可以通过多途径影响中枢神经系统免疫反应并在中枢放大免疫炎症机制，免疫炎症机制可通过作用于抑郁症的其他机制发挥作用。本研究通过慢性不可预知温和应激联合孤养方式建立抑郁症大鼠模型，观察开心解郁方对该模型大鼠行为学、血清促炎性细胞因子的影响，探讨开心解郁方的抗抑郁效应与作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级健康成年雄性SD大鼠48只，体重（195±6）g，购自北京维通利华试验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2012-0001。整个试验是在广安门医院伦理委员会的许可和监督下进行的。

1.2 试验药物

开心解郁方由柴胡、赤芍、巴戟天、茯苓、人参、枳实、远志、甘草八种中药以3∶3∶3∶3∶2∶2∶3∶2的比例组成，在开心解郁方的成药性研究中进行制剂工艺筛选后，由广安门医院大兴制剂中心制备成了浓缩水丸，每克丸剂含2.58克生药量。按照成人每日9克丸剂的用药量与成人体重60千克计算，成人用药剂量为0.15g丸剂/千克/天。根据开心解郁方前期大、中、小剂量的药效学、病理形态学、分子生物学动物实验研究[10][11]综合分析后，中剂量效果更好，所以，本次试验中，大鼠按照成人每日用量的6倍量0.9g丸剂/千克/天为等效剂量，也就是中剂量。使用前配制方法：27克丸剂研成细末倒入量杯，加纯净水至300毫升，浓度为0.09克/毫升，放入药瓶，4℃冷藏。

1.3 主要仪器与试剂

FST-100睡眠剥夺与强迫游泳视频分析系统（成都泰盟科技有限公司）；全自动多功能酶标仪（美国Thermo公司）；电热恒温培养箱（天津泰斯特公司）；蔗糖（分析纯）、水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司）；IL-1β、IL-2，IL-6，TNF-α，ELISA 试剂盒（CUSABIO公司）。

1.4 动物分组与给药

大鼠每笼5只适应性喂养3天，饲养时保持温度21-22°C，明暗时间各12 h，自由食水。适应环境结束后编号、称重、行糖水偏好试验，根据糖水消耗百分率、体质量分为正常组、模型组、中药组。中药组在慢性温和应激开始的第1天开始灌胃给药，根据大鼠体重给药，即每100克体重给已经配好的药1毫升。给药前，将中药放在室温下30分钟待恢复常温；正常组和模型组给予相同体积的纯净水。根据体重的变化，每周进行灌胃剂量的调整，连续给药42天。

1.5 抑郁症模型的复制

采用慢性不可预知温和应激联合孤养制备大鼠抑郁模型。慢性温和应激：将动物予以夹尾1 min，禁水24 h，禁食24 h，4℃冰水游泳5 min，45℃环境5 min，明暗颠倒24 h，电击足底5 min（1 mA，30 v，每隔1 min刺激1次，每次10 s），潮湿垫料24 h，45°鼠笼倾斜24 h，水平振荡5 min等方法刺激。每天采取一种刺激，同样的刺激方式不能连续两天应用，使动物无法预料刺激的发生，共刺激42天。

孤养：正常组每笼4只，常规饲养；模型组与中药组在慢性应激的同时单笼隔离饲养。

1.6 行为学测试

应用糖水偏好试验与强迫游泳试验进行抑郁模型大鼠的行为学检测。

造模前、造模后第42天行糖水偏好试验。试验时各组大鼠糖水偏好试验需要大鼠适应性喝糖水两天、禁食禁水1天，即第1天每笼放置2瓶1%蔗糖水，第2天1瓶糖水，1瓶纯净水，2瓶位置随机；第3天上午9：00开始禁食禁水；第4天9：00正式的糖水试验，给每只大鼠随机放置2个水瓶，分别放有事先称重的1%蔗糖水和纯净水，120 min后，取2瓶水再次称重。记录每只大鼠的糖水消耗量、纯净水消耗量，按糖水消耗量占总消耗水量的百分比计算糖水偏好。

在造模后第43天进行强迫游泳试验，采用成都泰盟科技有限公司的FST-100睡眠剥夺与强迫游泳视频分析系统，装置置于安静的房间，由长348 mm，宽348 mm，高445 mm的玻璃水箱组成，装置内有直径200 mm，高400 mm的圆筒玻璃隔板，用于限制大鼠的活动范围。向玻璃装置内放水，深度为30 cm，温度为25℃。将大鼠放入圆筒内，每只大鼠单独测试、不同组大鼠交替进行观察记录5 min内的挣扎、游泳、漂浮时间，全过程使用摄像头-电脑连接装置自动记录。本次试验采用大鼠的漂浮时间即不动时间作为评价指标。

1.7 血清促炎性细胞因子测定

①血清采集与处理：取材前一天配10%水合氯醛备用，取材时按照0.35 ml/100 g体重腹腔麻醉，腹主动脉取血5 ml，室温静置2小时后离心，4℃,1500 rpm，离心30分钟，吸取上部血清，-80℃冰箱冻存。

②酶联免疫吸附(ELISA)法测定大鼠血清炎性细胞因子IL-1β,IL-2,IL-6,TNF-α的表达：按照ELISA试剂盒说明书测定上述炎性因子浓度。

1.8 统计方法

采用SPSS16.0统计软件先对试验结果进行正态性检验，本试验计量资料均符合正态分布，所测数据均以均值±标准差(xˉ±s)表示；各指标组间比较均采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，若数据符合方差齐，两两比较选用LSD检验；若出现方差不齐时，应用Welch近似方差分析，两两比较采用Tamhane's T2检验；检验标准均为0.05

表1 各组大鼠体重比较 ±s,g)

表1 各组大鼠体重比较 ±s,g)

注：与正常组比较##P＜0.01。

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图1 造模前后各组大鼠糖水偏好的变化

图2 造模前后各组大鼠饮水总量的变化

图3 开心解郁方对抑郁模型大鼠强迫游泳不动时间的影响

表2 血清炎性细胞因子ELISA数据(±s,pg/ml)

表2 血清炎性细胞因子ELISA数据(±s,pg/ml)

注：与正常组比较#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较△P＜0.05，△△P＜0.01

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2 结果

2.1 造模前后各组大鼠体重比较

试验过程中记录了分组造模前与造模开始后第24天、第43天的体重，见表1。模型组、中药组大鼠在造模第24天与造模结束后体重与正常组比较，均显著降低（P＜0.01），中药组与模型组无差异（P＞0.05）

2.2 糖水偏好试验结果

各组大鼠造模前的糖水偏好无差异（P＞0.05）；造模42天后，模型组大鼠糖水偏好百分比显著低于正常组（P＜0.01），开心解郁方干预的中药组糖水偏好显著高于模型组（P＜0.01），见图1。总饮水量，见图2，三组基线水平无差异（P＞0.05），造模结束后，模型组总饮水量显著少于正常组（P＜0.01），中药组可增加模型大鼠的饮水量（P＜0.05）。

2.3 强迫游泳

造模43天后，模型组大鼠的不动时间明显高于正常组（P＜0.01）；与模型组比较，中药组漂浮时间明显缩短（P＜0.05），但仍高于正常组（P＜0.05），见图3。

2.4 各组血清促炎性细胞因子的表达浓度

如表 2，四种炎性细胞因子 IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α，模型组的表达水平均显著高于正常组（P＜0.01）；与模型组相比，中药组IL-2、TNF-α表达浓度显著降低（P＜0.01），IL-1β、IL-6表达浓度也显著降低（P＜0.05）；中药组的IL-1β、IL-2、TNF-α表达水平与正常组比较仍存在明显差异（P＜0.01）。

3 讨论

3.1 慢性不可预知温和应激抑郁模型

抑郁症是一种以心境抑郁，丧失兴趣或愉悦感为主要特征的情感性精神障碍[12]，它的核心症状情绪低落，丧失兴趣，无价值感和容易出现的死亡或自杀念头，在试验动物难以复制评价，因此抑郁的研究者们不断试图从不同角度探索抑郁 模型[13]。慢性不可预知温和应激模拟了临床上抑郁症核心症状——对奖赏的感受力下降，即快感缺失，同时可表现出抑郁障碍的其他症状，如运动能力及社会交往能力下降、探索行为能力下降、侵犯攻击能力缺陷、性行为能力下降等。慢性不可预知温和应激抑郁模型是将动物长时间置于一系列不可预见、轻度的应激环境中，模拟人们在日常生活中所经历的慢性的、低强度的应激性生活事件而建立抑郁模型，与人类抑郁症发病原因更接近。多变性和不可预测性是模型制造成功的关键，该模型目前存在文献报道说法不一、应激强度难以掌控的问题，有学者对该模型的稳定性提出过质疑，但该模型的提出者Willner P[14][15]通过文献整理与对相关试验室的问卷调查证实了该模型是高度可靠的抑郁症动物模型，但在不同试验室复制时可能会有差异。糖水偏好试验是一种有效的行为检测，用来评估抑郁模型动物快感缺乏症状。慢性不可预知温和应激可引起大鼠糖水偏好下降，在比较糖水消耗百分比同时，有的文献比较了总的饮水量，慢性应激可导致模型动物总饮水量的下降，抗抑郁药可逆转糖水偏好试验中的这些异常行为[16-17]。强迫游泳试验是常用来评价应激后啮齿类动物抑郁样行为的检测方法，强迫游泳试验中动物的漂浮时间代表行为绝望的程度，以模仿抑郁症患者的绝望心理[18-19]。慢性不可预知温和应激可引起大鼠不动时间延长，可被抗抑郁药逆转。

本试验采用文献报道较多的慢性不可预知温和应激与孤养结合的方式[20]建立大鼠抑郁模型，对建立此模型的效果进行了验证，这种应激方式使大鼠体重、糖水偏好、饮水总量显著下降，不动时间显著延长，一定程度上说明模型较成功。开心解郁方干预后，显著增加了抑郁模型大鼠的糖水偏好、饮水总量，降低了不动时间，对体重无影响。临床中，我们发现开心解郁方可改善抑郁症患者不思饮食的症状，在以后的研究中应加入模型大鼠饮食量的变化。本次实验中造模前基线水平的糖水偏好较课题组以往实验和文献报道的均低，模型结束后正常组的糖水偏好检测与以往研究接近，分析其原因可能与适应性喂养3天时间较短，适应性喂养3天后就被单笼饲养做糖水试验预适应有关，对新环境的不适应与突然的隔离使大鼠产生短暂的抑郁状态，影响了对糖水的偏好，以后的试验中应如大多数文献说明的适应1周为宜。

3.2 促炎性细胞因子与抑郁症

目前认为，抑郁症是遗传与环境通过多种机制相互作用的结果，涉及多种病理生理进程，单胺类递质的失衡、下丘脑-垂体-肾上腺轴的过度活化，生长因子与神经肽的变化，谷氨酸神经递质的改变，神经再生的损伤、免疫炎症活化等[21]。基于以往的研究证据Maes[22]提出了抑郁症的免疫炎症假说，认为抑郁症伴有免疫系统的激活与炎症反应，涉及免疫细胞增殖活化，细胞因子、前列腺素、相关蛋白、抗体的异常表达。细胞因子主要由外周免疫细胞合成和分泌，也可由中枢神经细胞、胶质细胞合成分泌，在免疫炎症反应中起着十分重要的作用。尽管文献报道的炎性细胞因子在抑郁症中研究结果有些不同，但是目前普遍认为抑郁症的免疫炎症假说主要表现为促炎性细胞因子的增多，抗炎性细胞因子的减少[23]。荟萃也分析[24-25]显示IL-1、IL-6、TNF-α等前炎性细胞因子在抑郁症患者的血清和脑脊液中高表达，在抑郁症模型动物脑区、外周中同样高表达[26-27]，抗抑郁治疗可以逆转这种情况。外周的细胞因子可通过多种途径进入中枢系统，激活脑内炎症信号[21]，可扩大中枢炎症效应，介导抑郁症的上述其他病理机制[28-29]。基于炎症因子在抑郁症中的作用，以炎症因子为靶点的抗抑郁治疗也在不断探索[30]。本次试验通过酶联免疫吸附法检测了血清炎症细胞因子浓度，证实开心解郁方能改善抑郁症模型大鼠的抑郁状态可能与调节血清促炎性细胞因子的表达水平相关。

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Effect of Kai-Xin Jie-Yu Prescription on Behavior and Serum Inflammatory Cytokines in Rat Model of Depression

Ma Li,Zhang Ying,Pan Juhua,Wang Yanyun,Sun Mengyun,Huang Shijing
(Guang’anmen Hospital,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100053,China)

This study was aimed to explore the antidepressant effect ofKai-Xin Jie-Yu(KXJY)prescription on depressive model of rats,and to explore the level of inflammatory cytokines in peripheral blood.According to sucrose preference and weight,male SD rats were randomly divided into the normal group,model group and traditional Chinese medicine(TCM)group.The model of depression was established by chronic unpredictable mild stress and separation for 6 weeks.Body weight,sucrose preference and forced swimming test were used to evaluate the depressive state.The levels of IL-1β,IL-2,IL-6 and TNF-α in the serum of rats were measured by ELISA.The results showed that compared with the normal group,the weight,sucrose preference and total drinking water of rat model group were significantly reduced.The immobility time of forced swimming was significantly prolonged.The level of IL-1β,IL-2,IL-6 and TNF-α expression in serum was significantly increased.There was no significant difference between the body weight of rats in the model group and TCM group.The total amount of drinking water and sucrose preference were significantly increased.The immobility time of forced swimming was reduced.Levels of IL-1β,IL-2,IL-6 and TNF-α expression were decreased significantly.It was concluded that KXJY prescription can improve depression symptoms in depression model of rats.It may be related to regulate the expression level of serum inflammatory cytokines.

Kai-Xin Jie-Yuprescription,depression,inflammatory cytokines,chronic unpredictable mild stress and stress behavior

10.11842/wst.2017.08.013

R749.92

A

2017-05-11

修回日期：2017-05-26

＊ 国家自然科学基金面上项目（No.81573790）：基于lncRNA-miRNA网络对神经血管单元稳态调控探讨益气开郁中药抗抑郁机制，负责人：黄世敬。北京市科技计划（No.Z161100001816013）：开心解郁颗粒治疗血管性抑郁的成药性研究，负责人：黄世敬。

＊＊ 通讯作者：黄世敬，研究员，主任医师，博士研究生导师，研究方向：中医脑病、心身疾病及中药研发。

（责任编辑：韩馥蔓，责任译审：王 晶）