高效液相色谱法同时测定白虎加桂枝汤中5个有效指标性成分的含量

彭 平，王梦婕，李晓盈，段湘宁，李毅腾，杜 菁

（北京中研同仁堂医药研发有限公司 北京 100079）

高效液相色谱法同时测定白虎加桂枝汤中5个有效指标性成分的含量

彭 平，王梦婕，李晓盈，段湘宁，李毅腾，杜 菁＊

（北京中研同仁堂医药研发有限公司 北京 100079）

目的：建立白虎加桂枝汤中芒果苷、新芒果苷、甘草酸、甘草苷、肉桂酸5个有效指标性成分的含量测定方法，为白虎加桂枝汤的颗粒研发奠定基础。方法：采用HPLC-PDA双波长同时测定，Waters xBridge BEH C18（4.6 mm×250 μm，5 μm）色谱柱，流动相乙腈-0.01%甲酸水，梯度洗脱，流速1 mL·min-1，柱温24℃，检测波长255 nm、280 nm。结果：内芒果苷、新芒果苷、甘草酸、甘草苷、肉桂酸线性范围分别为66-1 976 μg（r=0.999 3），70-3 487 μg（r=0.999 7），30-913 μg（r=0.999 5），35-1 734 μg（r=0.999 5），0.6-187 μg（r=0.999 8），加样回收率平均范围95.29%-100.17%。结论：建立了白虎加桂枝汤中5个有效指标性成分的含量测定方法，该方法简捷、稳定、准确，可为白虎加桂枝汤及其复方颗粒研制的质量控制提供评价方法。

白虎汤 芒果苷 甘草苷 肉桂酸

白虎加桂枝汤，方出《金匮要略·疟病脉证治》篇[1]。该方为白虎汤加桂枝组成，方药由知母、炙甘草、石膏、粳米、桂枝五味组成，主治“温疟”之症，具有清热生津，兼解表邪的功效[2,3]。研究发现，白虎汤中石膏与其他药味的协同作用是白虎汤具有显著退热作用的关键[4-6]。知母中的芒果苷、新芒果苷，炙甘草中的甘草苷、甘草酸，以及桂枝中的肉桂酸，是白虎加桂枝汤发挥药效作用的主要活性成分[7-11]。因此，测定这5个有效指标性成分的含量对于白虎加桂枝汤的质量控制具有重要的意义。现已有文献报道使用乙腈-磷酸二氢钾盐溶液为流动相，同时测定白虎汤中4个指标成分的方法[12]，尚未见白虎加桂枝汤的分析方法报道。

近年来，随着中药研究的不断发展，对中药经典配方颗粒的研制及其如何进行有效质量控制成为中药配方颗粒研制的核心问题[13-15]。为了探究白虎加桂枝汤复方颗粒的研制及其有效质量控制相关问题，为中药经方颗粒的研制提供科学依据，笔者进行了较为系统的研究。本研究建立了HPLC-PDA测定白虎加桂枝汤复方中5个有效指标性成分（新芒果苷、芒果苷、甘草苷、甘草酸、肉桂酸）的含量测定方法，为白虎加桂枝汤复方颗粒的研制及其质量控制奠定基础。

1 材料

1.1 饮片

生石膏（批号：160968）、知母（批号：161038）、炙甘草（批号：1609120）、桂枝（批号：160944）均购自河北博圣药业有限公司，经复检，符合2015年版《中国药典》（一部）规定。粳米使用普通食用大米。

1.2 样品制备

根据现代中医医院临床汤剂的煎煮方法，以处方量，称取石膏50 g，知母18 g，甘草6 g，粳米6 g，桂枝9 g，使用广兴电砂锅（型号03B/4L），加入600 mL水，设定煎煮45 min，采用纱布过滤，滤液60℃减压回收溶剂，60℃真空干燥，即得白虎加桂枝汤提取物。

1.3 仪器

2695高效液相色谱仪包括四元泵，2996 DAD检测器，柱温箱，自动进样器，Empower工作站（美国Waters公司）；纯水仪（型号：Milli-Q Academic A10厂家：美国MILLIPORE）；KQ-250DE型数控超声波器（昆山超声仪器有限公司）；MettlerML204型电子分析天平（瑞士梅特勒-托利集团）；XP205型电子分析天平（瑞士梅特勒-托利集团）；0.45 μm微孔滤膜（天津津腾实验设备有限公司）。

图1 255 nm波长下对照品混合溶液色谱图

图2 280 nm波长下对照品混合溶液色谱图

图3 255 nm波长下白虎加桂枝汤提取物样品溶液色谱图

图4 280 nm波长下白虎加桂枝汤提取物样品溶液色谱图

1.4 对照品

新芒果苷对照品（含量98%，上海源叶生物有限公司，批号：B21397）。肉桂酸（含量100%，批号110786-200503）；芒果苷（含量98.4%，批号111607-201503）；甘草苷（含量93.7%，批号111610-201106）；甘草酸铵（含量93.1%，中国食品药品检定研究院批号110731-201418）。

1.5 对照品溶液的制备

分别用50%甲醇配制供定量使用的对照品溶液，新芒果苷348.7 μg·mL-1，芒果苷329.4 μg·mL-1，甘草酸152.1μg·mL-1，甘草苷173.4μg·mL-1，肉桂酸31.2μg·mL-1。

1.6 供试品溶液的制备

精密称取白虎桂枝汤提取物干膏细粉0.35 g，置于具塞三角瓶中，精密加入25 mL50%甲醇，称定重量，超声（功率250 W，50 kHz）使溶解，放冷，用提取溶剂补重，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适应性

色谱柱采用沃特世xBridgeBEHC18Column（4.6mm×250 μm，5 μm），柱温24℃。流动相为A乙腈-B0.01%甲酸水，梯度洗脱（0-15 min，5%A；15-17 min，5-10%A；17-22 min，10-17%A；22-24 min，17-19%A；24-33 min，19-20%A；33-45 min，20%-35%A；45-55 min，35%-42%A；55-58 min，42%-42%A；55-58 min，42%-42%A；58-65 min，42%-5%A），流速1 mL·min-1。新芒果苷、芒果苷、甘草酸在255 nm波长下进行检测，甘草苷、肉桂酸在280 nm波长下进行检测，进样量10 μL，采集时间70 min，理论塔板数按芒果苷计算不低于5 000。色谱图见图1-4。

2.2 线性关系考察

将5个对照品母液分别用50%甲醇稀释为7个梯度，其中肉桂酸质量浓度依次为18.7、9.4、6.2、3.1、0.12、0.06 μg·mL-1，甘草苷质量浓度依次为173.4、52.0、34.7、17.3、6.9、3.5 μg·mL-1，甘草酸质量浓度为91.3、45.7、30.4、15.2、6.1、3.0 μg·mL-1，芒果苷质量浓度为197.6、98.8、65.9、32.9、13.2、6.6 μg·mL-1，新芒果苷质量浓度为348.7、104.6、69.7、34.9、13.9、7.0 μg·mL-1。每个梯度质量浓度进样10 μL，平行进样两针，计算平均峰面积。以进样量X(μg)为横坐标，对照品峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线。建立色谱峰面积对进样量的回归方程（表1），结果表明，各成分在检测的浓度范围内线性关系良好。

2.3 精密度考察

取同一样品溶液，连续进样6次，进样量均为10 μL，记录峰面积值，计算RSD值，结果甘草苷、甘草酸、芒果苷、肉桂酸、新芒果苷峰面积的RSD分别为0.73、2.46、0.49、1.50、0.36%，表明仪器精密度良好。

2.4 重复性考察

取样品6份，分别按样品处理方法制备样品溶液，并进样测定，记录峰面积，计算各指标性成分含量。结果甘草苷、甘草酸、芒果苷、肉桂酸、新芒果苷平均含量分别为0.81、1.07、6.39、0.13、9.38 mg·g-1；RSD分别为1.33、1.65、0.53、0.86、0.57%。表明该方法重复性良好。

2.5 稳定性考察

取同一样品溶液，分别于0、3、6、9、12、24 h进样测定，进样量均为10 μL。结果甘草苷、甘草酸、芒果苷、肉桂酸、新芒果苷峰面积的RSD分别为0.86、2.26、0.58、1.63、0.45%，表明样品溶液在24 h内基本稳定。

2.6 加样回收率考察

取已知指标性成分含量的本复方提取物干膏粉末6份，每份175 mg，每份分别加入浓度为348.7 μg·mL-1的新芒果苷溶液2 mL，浓度为329.4 μg·mL-1的芒果苷3 mL，浓度为0.152 1 μg·mL-1的甘草酸1.2 mL，浓度为173.4 μg·mL-1的甘草苷0.9 mL，浓度为31.2 μg·mL-1的肉桂酸0.9 mL，再加入50%甲醇20 mL，共计28 mL溶剂，称定重量，超声(250 w，50 kHz)使溶解，放冷，用50%甲醇溶液补足重量，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，进样10 μL测定。根据测得的各成分的量，计算各成分的加样回收率和RSD，结果见表2～6。

2.7 样品测定

分别取芒果苷、新芒果苷、甘草苷、甘草酸铵、肉桂酸对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成含芒果苷90 μg·mL-1、新芒果苷100 μg·mL-1、甘草苷35 μg·mL-1、甘草酸30 μg·mL-1、肉桂酸6 μg·mL-1的混合溶液。

取对照品混合溶液和样品溶液，按照已建立的分析方法测定，采用外标一点法测定样品中甘草苷、甘草酸、芒果苷、肉桂酸、新芒果苷的含量，结果见表7。

表1 5种有效成分的回归方程、相关系数和线性范围

表2 甘草苷的加样回收率实验（n=6）

表3 甘草酸的加样回收率实验（n=6）

表4 芒果苷的加样回收率实验（n=6）

表5 肉桂酸的加样回收率实验（n=6）

表6 新芒果苷的加样回收率实验（n=6）

表7 三批白虎加桂枝汤提取物测定结果（n=2）

3 讨论

3.1 样品处理方法的建立

样品处理方法对比了回流和超声两种处理方法，得出两种处理方式无明显差异，优选超声处理；考察了甲醇、50%甲醇、水三个不同溶剂对样品中5个指标性成分的溶解度，以相同样品浓度下5个指标性成分峰面积最大为依据，选择溶剂为50%甲醇溶剂；考察50%甲醇溶剂倍量25、50、100倍对样品的溶解度，以指标性成分测定含量值最大为依据，选择100倍的溶剂倍量。

3.2 色谱条件选择

已有文献报道使用乙腈-磷酸二氢钾盐溶液梯度洗脱，在256 nm波长下测定白虎汤中4个指标性成分[6]。本实验考察使用了较为方便的乙腈-甲酸-水为流动相，通过优化洗脱梯度，使得测定的5个指标性成分色谱峰均达到较好的分离度。

3.3 检测波长选择

根据5个指标性成分的最大吸收波长（芒果苷255 nm、新芒果苷255 nm、甘草酸255 nm、肉桂酸280 nm、甘草苷280 nm），选用双波长同时测定，选定255 nm、280 nm为检测波长，提高了分析方法的灵敏性和准确性。

本文建立了HPLC同时测定白虎加桂枝汤中5个有效指标性成分芒果苷、新芒果苷、甘草苷、甘草酸、肉桂酸的含量测定方法，已成功用于白虎加桂枝汤复方颗粒的研制，该方法简捷、稳定、准确。

1 胡爽杨.《金匮要略》白虎加桂枝汤治疗小儿咳嗽的临床应用心得.环球中医药,2013,6(S1)：58-58.

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4 夏怡,李祥,陈建伟,等.石膏及白虎汤清热泻火功效的实验研究.现代中药研究与实践,2009,23(2)：48-51.

5 王娅,冯芳,孙丽丽.白虎汤配伍谱效关系研究.药学与临床研究,2010,18(3)：226-230.

6 马强,李晓晶,顾丽,等.白虎汤不同配伍对甘草酸含量的影响.中华中医药杂志,2011,(9)：2049-2051.

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12 王智民,叶祖光,肖诗鹰,等.对中药配方颗粒发展的几点建议和应用前景分析.中国中药杂志,2004,29(1)：5-7.

13 崔景朝,赵自明.中药配方颗粒研究进展(Ⅱ)——中药单煎与合煎对比研究概况.中国实验方剂学杂志,2011,17(4)：240-245.

14 李松林,宋景政,徐宏喜.中药配方颗粒研究浅析.中草药,2009,40(S1)：1-7.

Simultaneous Determination of Five Components in Baihu and Guizhi Decoction by HPLC

Peng Ping,Wang Mengjie,Li Xiaoying,Duan Xiangning,Li Yiteng,Du Jing
(Beijing Zhongyan Tongrentang Medicine Research Company,Beijing 100079,China)

This study was aimed to develop an HPLC method for simultaneous determination of five active components inBaihuandGuizhidecoction.Simultaneous determination of mangiferin,neomangiferin,glycyrrhizic acid,liquiritin,and cinnamic acid in Baihu and Guizhi decoction were conducted by HPLC-PDA under multiple UV wavelengths.An Waters xBridge BEH C18Column(4.6 mm × 250 μm,5 μm)was used.The mobile phase was acetonitrile-0.01%formic acid solution.The flow rate was 1 mL·min-1.The column temperature was kept at 24°C.The detection wavelength was set at 255 nm and 280 nm.The results showed that the linear range of mangiferin,neomangiferin,glycyrrhizic acid,liquiritin,and cinnamic acid was 66-1 976 μg(r=0.999 3),70-3487 μg(r=0.999 7),30-913 μg(r=0.999 5),35-1 734 μg(r=0.999 5),0.6-187 μg(r=0.999 8)in 70 min,respectively.The average recovery was between 95.29%and 100.17%.It was concluded that the method was convenient,stable,reliable and accurate for simultaneous determination of the five components inBaihuandGuizhidecoction.It provided an evaluation method for the quality control ofBaihuandGuizhidecoction and the research o its granules.

Baihudecoction,mangiferin,liquiritin,cinnamic acid

10.11842/wst.2017.08.024

R284.1

A

2017-05-31

修回日期：2017-06-06

＊ 通讯作者：杜菁，工程师，主要研究方向：中药新药工艺及质量控制。

（责任编辑：张娜娜，责任译审：王 晶）