白术黄芪汤乙酸乙酯提取物对巨噬细胞NLRP3炎症小体的作用研究＊

沈佳雯，樊丹平，邱雪梅，吕爱平，何小鹃，耿 耘＊＊

（1.西南交通大学生命科学与工程学院成都610031；2.中国中医科学院中医临床基础医学研究所北京 100700；3.香港浸会大学中医药学院 香港 999077）

白术黄芪汤乙酸乙酯提取物对巨噬细胞NLRP3炎症小体的作用研究＊

沈佳雯1，樊丹平2，邱雪梅1，吕爱平3，何小鹃2，耿 耘1＊＊

（1.西南交通大学生命科学与工程学院成都610031；2.中国中医科学院中医临床基础医学研究所北京 100700；3.香港浸会大学中医药学院 香港 999077）

目的：观察白术黄芪汤乙酸乙酯提取物对巨噬细胞NOD样受体-3（NLRP3）炎症小体的影响。方法：用佛波酯（PMA）（10 ng·mL-1）刺激U937细胞48 h，诱导其成为巨噬细胞，观察不同剂量白术黄芪汤乙酸乙酯提取物（0，3.125，6.25，12.5，25，50，100 μg·mL-1）对细胞活力的作用，并选择合适的浓度。采用实时荧光定量（RT-PCR）和免疫印迹法（Western blot）测定细胞中NLRP3，半胱天冬酶-1（caspase-1）的含量，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测细胞上清液中白细胞介素（IL）-1β的含量。结果：细胞计数试剂盒（CCK-8）实验表明，当药物浓度低于25 μg·mL-1时，对细胞活力没有影响，当药物浓度高于50 μg·mL-1时，对细胞活力有抑制作用（P＜0.05），选择25 μg·mL-1浓度进行后续实验。与空白组相比，LPS组细胞中NLRP3，caspase-1表达明显增加（P＜0.01），细胞培养上清中的IL-1β浓度也明显增高（P＜0.01）。白术黄芪汤乙酸乙酯提取物作用后，NLRP3，caspase-1，IL-1β表达均明显下降（P＜0.05）。结论：白术黄芪汤乙酸乙酯提取物对LPS刺激的巨噬细胞NLRP3炎症小体有抑制作用。

炎症小体 白术黄芪汤乙酸乙酯提取物 NLRP3 caspase-1 IL-1β

溃疡性结肠炎是以局部黏膜的溃疡、出血、糜烂为主要表现的慢性非特异性炎性自身免疫病[1]，目前仍然缺乏有效治疗药物。研究显示，巨噬细胞在溃疡性结肠炎发病过程中发挥重要作用，可通过分泌IL-1β等破坏肠黏膜屏障的细胞因子从而影响炎症的发展方向[3]。NLRP3炎症小体是巨噬细胞中参与炎症反应的重要组成部分，现代研究证明其参与维持了肠道内环境的稳定。一方面，肠内病原体等不良因素可以激活NLRP3炎性体，激发肠道固有免疫发挥屏障防御作用；另一方面，炎性体的激活可导致IL-1β家族炎性因子分泌过多，加重肠黏膜炎症反应造成肠道损伤[4]。

白术黄芪汤最早出自《刘河间医学六书·素问病机气宜保命集·泻痢论·卷十九》，根据原文所述，“白术黄芪汤，服前药，痢虽已除，犹宜此药和之。……白术一两，黄芪七钱，甘草三钱”。近年来，已有多篇报道证实白术黄芪汤对溃疡性结肠炎有治疗作用，且有一定的抗炎作用[5,6]，我们前期研究发现：白术黄芪汤乙酸乙酯提取物能够抑制LPS刺激的巨噬细胞中IL-1β的表达，减轻细胞炎症反应。上述研究提示白术黄芪汤能够抑制细胞炎症反应作用，然而，其是否通过调节NLRP3炎症小体抑制巨噬细胞炎性因子的释放目前仍不清楚。本实验以人单核巨噬细胞系U937细胞为研究对象，以NLRP3炎症小体为切入点，采用体外培养方法，构建体外炎症模型，探究白术黄芪汤乙酸乙酯提取物治疗溃疡性结肠炎的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

白术黄芪汤乙酸乙酯提取物由奥地利格拉茨大学Rudolf Bauer教授提供；U937细胞（购自北京协和医院基础医学研究所细胞中心）；RPMI1640培养基（美国Gibcol公司，22400089）；胎牛血清（美国Gibcol公司，10099141）；双抗（美国Gibcol公司，15070063）；磷酸盐缓冲液（PBS）（美国HyClone公司，SH30256.01B）；脂多糖（美国Sigma公司，L-2880）；佛波酯（PMA）（美国Sigma公司，P1585）；CCK-8检测试剂盒（日本DOjinDO公司，CK04）；TRNzol总RNA提取试剂（天根生化科技有限公司，DP405-02）；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（日本 TaKaRa公司，RR047A）；SYBR®Premix Ex TaqTM（TliRNaseH Plus）（日本TaKaRa公司，RR420A）；β-actin抗体（英国abcam公司，ab8227）；NLRP3抗体（abcam，ab214185）；Caspase-1抗体（英国abcam公司，ab1872）；RIPA裂解液（强）（碧云天生物技术，P0013）；蛋白酶抑制剂PMSF（碧云天生物技术，ST506-2）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）（碧云天生物技术，P0010）；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（碧云天生物技术，P0012A）；人IL-1βELISA试剂盒（美国eBioscience公司，BMS224/2）。

1.2 仪器

CO2培养箱（美国Thermo公司）；倒置相差显微镜（德国Leica公司）；酶标分析仪（美国Thermo公司）；高速冷冻离心机（美国sigma公司,Laboratory Centrifuges 3K15）；电热恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂，XMTD-204）；生物安全柜（Thermo Scientific，MSC-ADVANTAGE）；涡旋震荡仪（其林贝尔仪器制造有限公司，QL-902）；荧光定量PCR仪（AppliedBiosystems，AB17500）；制冰机（美国Thermo公司，Forma-86CULT）；蛋白核算凝胶成像系统（昊特伟业科技有限公司，Fluor Chem FC2）；电泳仪（美国 Bio-Rad公司，A101439）；电泳槽（美国Bio-Rad公司，1658003）。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养

U937细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，于37℃，5%CO2培养箱中静置培养，换液方式为半保留换液，每2天传代一次。

1.3.2 细胞活力检测

实验取培养至对数生长期的U937细胞，接种于96孔板中，每孔细胞数为1×105个，加入终浓度为10ng·mL-1的PMA诱导细胞贴壁，置于培养箱中培养48 h。弃上清，加入含不同浓度药物的新鲜培养基。实验设置7个组：0，3.125，6.25，12.5，25，50，100 μg·mL-1组，每组做3个复孔。培养24 h后，每孔中加入10 μL CCK-8，再培养3 h后，450 nm处检测吸光度值。

1.3.3 给药实验

选择对数生长期的U937细胞，用RPMI1640完全培养基调整细胞浓度至5×105mL-1接种于6孔板，每孔2 mL，加PMA诱导48 h使其成长为巨噬细胞后，吸弃全部上清液，用PBS冲洗两遍，LPS组和白术黄芪汤乙酸乙酯提取物给药组加入2 mL含LPS（1 μg·mL-1）的培养基，空白组加入2 mL RPMI1640，置于37℃5%CO2的培养箱中作用2 h后，给药组加入合适浓度的白术黄芪汤乙酸乙酯提取物，在培养箱中继续培养48 h后，收集各组细胞上清和细胞，以备检测。

1.3.4 RT-PCR检测细胞中NLRP3，caspase-1的表达

总RNA提取按照TRIzol试剂盒说明书进行。提出的RNA在测定浓度后，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒中的说明书逆转录合成cDNA。然后以cDNA为模板配置PCR反应体系，以内参β-actin作对照。所需引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列为：NLRP3-F：CATGAGTGCTGCTTCGACAT，NLRP3-R：GCTTCAGTCCCACACACAGA，caspase-1-F：GCTTTCTGCTCTTCCACACC，caspase-1-R：TCCTCCACATCACAGGAACA，βactin-F：CTGGGACGACATGGAGAAAA，β-actin-R：AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC。反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，退火60℃，10 s，共40个循环，延伸95 ℃，15 s，60 ℃，1 min，95 °C，15 s。

1.3.5 Westernblot检测细胞中NLRP3，caspase-1的表达

提取细胞总蛋白，SDS-PAGE电泳，将蛋白转移到PVDF上，用含5%脱脂奶粉的1×TBST封闭。分别加入NLRP3，caspase-1，β-actin一抗，孵育过夜，洗涤后加入HRP标记的山羊抗兔IgG（二抗）。暗室内ECL发光法检测目的条带，胶片曝光，显影，以β-actin为内参分析结果。

1.3.6 ELISA检测细胞上清中IL-1β的含量

将收集到的细胞上清，严格按照ELISA试剂盒说明书操作，每个样品均设3个复孔。反应终止后用酶标仪测450 nm处的吸光度（A450）值。根据标准品浓度和A值做标准曲线，计算样本A值对应的浓度值。

1.4 统计学处理

用SPSS18.0进行统计学分析，所有数据采用均数±标准（xˉ±s）表示，组间比较采用t检验和方差分析，P＜0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 白术黄芪汤乙酸乙酯提取物对巨噬细胞活力的影响

采用CCK-8法检测白术黄芪汤乙酸乙酯提取物对U937细胞的活力作用，确定白术黄芪汤乙酸乙酯提取物的给药浓度。如图1所示，与0 μg·mL-1相比，当药物浓度低于25 μg·mL-1时，对细胞活力没有影响，当药物浓度高于50 μg·mL-1时，对细胞活力有抑制作用（P＜0.05）。所以选择25 μg·mL-1白术黄芪汤作为最佳药物浓度。

2.2 白术黄芪汤乙酸乙酯提取物对LPS刺激的巨噬细胞NLRP3，caspase-1 mRNA表达的影响

图2显示，经LPS刺激后，巨噬细胞中NLRP3和caspase-1的mRNA水平显著上调（P＜0.05）；白术黄芪汤乙酸乙酯提取物作用后，NLRP3和caspase-1的mRNA水平均显著降低，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 白术黄芪汤乙酸乙酯提取物对LPS刺激的巨噬细胞NLRP3，caspase-1蛋白表达的影响

图3显示，与空白组相比，LPS组中NLRP3，caspase-1表达水平显著升高（P＜0.01）；与LPS组相比，给药组中NLRP3，caspase-1表达水平显著降低（P＜0.01）。

2.4 白术黄芪汤乙酸乙酯提取物对巨噬细胞上清中IL-1β的影响

采用ELISA法检白术黄芪汤乙酸乙酯提取物对巨噬细胞上清中IL-1β的影响。实验结果表明，与空白组相比（296.73±10.52），LPS组IL-1β含量较高（1277.63±19.21），差异具有统计学意义（P＜0.01），与LPS组相比，给药组细胞上清中的IL-1β表达（693.59±27.93）显著降低（P＜0.05）。

3 讨论

图1 白术黄芪汤乙酸乙酯提取物对巨噬细胞活力的影响

图2 白术黄芪汤乙酸乙酯提取物对细胞NLRP3，caspase-1 mRNA表达的影响

白术黄芪汤是金元医家刘完素用于治疗湿热痢疾恢复期的方药，由白术、黄芪、甘草三味药按照10∶7∶3的比例组方而成。现代研究显示，白术乙酸乙酯部位是其活性组分群，包含双白术内酯、苍术酮、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ等有效活性成分[7]，可以抗肿瘤[8]，增强机体免疫力[9]；黄芪乙酸乙酯部位中含有较多黄酮类物质[10]，在免疫调节，抗肿瘤方面有重要作用[11]。研究显示，甘草乙酸乙酯部位中的总黄酮有显著的抗炎效果[12]；白术黄芪汤原方为水煎剂，其乙酸乙酯提取物提取工艺简便、成本低，通过深入研究，将其研制成抗炎新药具有研究价值和应用前景，同时为了提高疗效并探讨白术黄芪汤抗炎作用的物质基础，本研究选用白术黄芪汤乙酸乙酯提取物。

图3 白术黄芪汤乙酸乙酯提取物对细胞NLRP3，caspase-1蛋白表达的影响

炎症小体通过招募半胱天冬酶-1前体（procaspase-1）并使2个相邻的pro-caspase-1发生自身水解，产生具有酶活性的caspase-1，介导IL-1β等炎症因子由前体形式转变为活化形式，分泌到胞外发挥生物学功能[13]。越来越多的研究表明：NLRP3与溃疡性结肠炎之间有着密切的关系，炎症小体的激活可导致炎性因子分泌过多，加重肠黏膜炎症反应，最终造成肠道损伤。相关研究证明：白术黄芪汤治疗溃疡性结肠炎作用明显，能够降低相关的炎性因子[14]，而NLRP3炎症小体是炎症调节的核心，提示白术黄芪汤有可能通过NLRP3炎症小体治疗溃疡性结肠炎。

本研究结果提示：利用LPS刺激巨噬细胞，建立体外炎症模型，并用白术黄芪汤乙酸乙酯提取物干预，发现药物能够显著降低炎性巨噬细胞NLRP3，caspase-1的表达，同时能够抑制细胞分泌炎症因子IL-1β，提示白术黄芪汤乙酸乙酯提取物对LPS刺激的巨噬细胞NLRP3炎症小体有抑制作用。由于体外实验在准确反映体内环境方面存在一定局限，本研究只是用该实验方法得到初步的观察结果，还需要动物实验进行进一步探索。该研究可作为相关动物实验研究基础，这也为白术黄芪汤治疗溃疡性结肠炎作用机制研究打下基础。

致谢：感谢奥地利格拉茨大学Prof.Rudolf Bauer课题组为本课题提供相关药品。

1 刘端勇,赵海梅,赵宁,等.八味锡类散对大鼠溃疡性结肠炎CD3,CD4,CD8T淋巴细胞的影响.中国中药杂志,2008,33(11)：1301-1304.

2 王新月,王建云.溃疡性结肠炎中医药治疗的关键问题与优势对策.中华中医药杂志,2012,27(2)：263-267.

3 吴闯,张海岩,姜在龙,等.巨噬细胞及相关细胞因子与溃疡性结肠炎发病机制相关性.中国中西医结合外科杂志,2011,17(5)：550-552.

4 罗书,李燕舞,巫燕莉,等.补中益气丸对溃疡性结肠炎小鼠结肠黏膜mRNA表达的影响.中成药,2016,38(3)：485-489.

5 李茹柳,迟莉,郭文峰,等.白术黄芪汤单药提取部位组方对不同病变阶段大鼠溃疡性结肠炎的影响.中国中药杂志,2008,33(2)：209-212.

6 亓国峰.白术黄芪汤及有效成分对溃汤性结肠炎的疗效.当代医学,2011,17(17)：156+155.

7 李伟.白术的有效物质及质量研究.南京：南京中医药大学博士学位论文,2001.

8 向小庆,叶红.白术抗肿瘤作用的研究及应用进展.中国实验方剂学杂志,2013,19(8)：367-370.

9 余上才,章育正,赵慧娟,等.枸杞子和白术免疫调节作用的实验研究.上海免疫学杂志,1994,14(1)：12-13.

10 刘小花,蔺兴遥,梁瑾,等.黄芪药材利尿作用的谱效关系研究.中国现代应用药学,2013,30(5)：491-495.

11 陈建真,吕圭源,叶磊,等.黄芪黄酮的化学成分与药理作用研究进展.医药导报,2009,28(10)：1314-1316.

12 杨晓露,刘朵,卞卡,等.甘草总黄酮及其成分体外抗炎活性及机制研究.中国中药杂志,2013,38(1)：99-104.

13 赵西宝,陈玮琳.炎症小体的活化及调控机制研究进展.细胞与分子免疫学杂志,2014,30(1)：101-103.

14 原扬,梁春波.白术黄芪汤辅助治疗溃疡性结肠炎效果及治疗前后炎症因子变化的观察.结直肠肛门外科,2016,22(3)：332-334.

Effects of Bai-Zhu Huang-Qi Decoction Extract on NLRP3 Inflammasome in Macrophages

Shen Jiawen1,Fan Danping2,Qiu Xuemei1,Lv Aiping3,He Xiaojuan2,Geng Yun1
(1.School of Life Science and Engineering of Southwest Jiaotong University,Chendu 610031,China;2.Institute of Basic Research in Clinical Medicine of China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100700,China;3.School of Chinese Medicine of Hong Kong Baptist University,Hong Kong 999077,China)

This study was aimed to observe the effect ofBai-Zhu Huang-Qi(BZHQ)decoction ethyl acetate extract on NOD like receptor family,pyrin domain-containing 3(NLRP3)inflammasome in macrophages.The U937 cells were pretreated with phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA,10 ng·mL-1)for 48 hours to induce macrophages.Effects on cell viability by different doses of BZHQ decoction ethyl acetate extract(0,3.125,6.25,12.5,25,50,100 μg·mL-1)were observed to select the appropriate concentration.Contents of NLRP3 and caspase-1 in cells were detected by real-time PCR and western blot.The concentration of interleukin-1β(IL-1β)in cell supernatant was detected by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).The cell counting kit-8(CCK-8)assay showed that when the drug concentration was lower than 25 μg·mL-1,there was no impact on cell viability;when the drug concentration was higher than 50 μg·mL-1,there was inhibition on cell viability(P＜ 0.05).The concentration of 25 μg·mL-1was used to conduct the following experiment.Compared to the blank group,the expression of NLRP3 and caspase-1 in cells of the LPS group were significantly increased(P＜0.01).The concentration of IL-1βin cell supernatant was also significantly increased(P＜0.01).After treated with BZHQ decoction ethyl acetate extract,levels of NLRP3,caspase-1 and IL-1βwere significantly decreased(P＜0.05).It was concluded that BZHQ decoction ethyl acetate extract can inhibit the production of NLRP3 inflammasome in LPS-stimulated macrophages.

Inflammasome,Bai-Zhu Huang-Qidecoction ethyl acetate extract,NLRP3,caspase-1,IL-1β

10.11842/wst.2017.08.019

R33

A

2017-04-20

修回日期：2017-07-20

＊ 国家国际科技合作专项项目（2014DFG32700）：中医药对慢性疾病的预防与早期干预的合作研究，主持人：刘保延。

＊＊ 通讯作者：耿耘，研究生导师，主要研究方向：中药作用机理工作。何小鹃，副研究员，主要研究方向：中药免疫药理研究。

（责任编辑：郭嫦娥，责任译审：王 晶）