核糖核酸酶A在端粒免疫荧光原位杂交实验中的应用

于芳，金蕊，黄君健

军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100850

核糖核酸酶A在端粒免疫荧光原位杂交实验中的应用

于芳，金蕊，黄君健

军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100850

目的：在端粒免疫荧光原位杂交实验中，降低核仁着色对端粒图像清晰度的影响。方法：分别将0.1、0.2、0.4 mg/mL的核糖核酸酶（RNase）A与待检标本于37℃消化过夜，然后进行端粒原位杂交实验。结果：0.4 mg/mL RNase A可以消除HepG2细胞端粒原位杂交时的非特异结合，使用HeLa、293T和U2OS细胞也有同样效果。结论：在进行端粒原位杂交实验时，用0.4 mg/mL RNase A消化核仁可减少探针的非特异结合，提高端粒图像的清晰度。

核糖核酸酶A；免疫荧光原位杂交（IF-FISH）；端粒

端粒是真核细胞线性染色体末端DNA重复序列（TTAGGG），在维护基因组稳定性和细胞生理内稳态中起重要作用[1]。研究发现端粒功能调控与各种疾病的发生密切相关，因此研究端粒DNA-蛋白质复合物的功能至关重要[2]。在敲低端粒相关蛋白后需要检测该蛋白的端粒定位情况，实验中最常用到荧光原位杂交技术（fluores⁃cencein situhybridization，FISH）。该技术是20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术[3-4]，基本原理是先把DNA（或RNA）探针用特殊的荧光染料标记，然后将探针直接杂交到染色体上，通过荧光染料发出的荧光进行DNA序列在染色体上的定位、定性、相对定量分析。我们使用该技术标记细胞中的端粒，在操作过程中，所用探针较短，长度一般为15 bp，且具有良好的穿透性，可用于标记端粒；但同时探针在杂交过程中特异性较弱，会与核仁发生非特异性结合，即除端粒结合外还有核仁的着色，影响实验结果。为了消除这种非特异性杂交，我们使用核糖核酸酶（RNase）A消化核仁，减小核仁对探针的影响，得到了较清晰的端粒图像，为下一步端粒的生物学研究提供了较好的数据。

1 材料与方法

1.1 材料

HepG2、HeLa、293T和U2OS细胞为本实验室保存；RNase A购于Sigma公司；抗端粒结合蛋白2（TRF2）抗体为Abcam公司产品；红色荧光标记抗体购自Invitrogen公司；Tel-CAF488FISH探针为BSI公司产品；4%多聚甲醛PBS和其他生化试剂均为国产分析纯产品；E-80i荧光正置显微镜为Nikon公司产品；杂交仪Thermo Brite为Leica公司产品。

1.2 免疫荧光（immunofluorescence，IF）

1.2.1 细胞接种 将消化好的待检测细胞HepG2用含10%胎牛血清的DMEM混匀后接种到事先放入盖玻片的12孔板中，于37℃、5%CO2培养箱内培养，24或48 h后观察细胞密度，达到70%～80%汇合后取出12孔板，弃DMEM培养液，用1×PBS涮洗1次。

1.2.2 固定 每孔加入600 μL 4%多聚甲醛（PFA），室温固定10 min，弃固定液，用1×PBS在水平摇床上洗3次，每次5 min。

1.2.3 封闭透化 每孔加入600 μL封闭液，室温摇床上透化30 min。

1.2.4 一抗结合 按照抗体说明书的要求用封闭液稀释抗TRF2抗体（一抗），每片盖玻片加25～30 μL，于37℃恒温孵育箱中结合1 h或在4℃冰箱中过夜，避光条件下用1×PBS洗片3次，每次5 min。

1.2.5 二抗结合 按照抗体说明书的要求用封闭液稀释二抗，每片盖玻片孵25～30 μL稀释抗体，于37℃恒温孵育箱中结合1～2 h，避光条件下用1×PBS洗片3次，每次5 min。

1.2.6 染核 用1×PBS按一定比例稀释DAPI，每孔加入600 μL染核液，避光染核5 min，荧光显微镜下观察染色情况，并拍照保存。

1.3 荧光原位杂交

1.3.1 RNase A消化核仁 将附着细胞的玻片放在分别含有 0.1、0.2、0.4 mg/mL RNase A 的 PBS液体中，37℃孵育过夜。

1.3.2 再固定 用4%PFA固定10 min，避光条件下用1×PBS洗盖玻片3次，每次5 min。

1.3.3 脱水处理 依次用75%、95%的乙醇和无水乙醇避光脱水处理5 min，室温避光干燥15 min，使其充分干燥。

1.3.4 杂交液配制 用商品化TELEAF488绿色荧光探针，稀释液含2%BSA、10 mmol/L Tris-Cl（pH7.2）、70%甲酰胺，探针按1∶100稀释使用。每个盖玻片孵育15～20 μL含100 nmol/L探针的杂交液，再用胶水将盖玻片的四周封闭保湿。

1.3.5 杂交仪工作设置 80℃变性处理10 min，37℃杂交2 h，再4℃过夜处理。

1.3.6 洗片 避光条件下用1×PBS洗片3次，每次5 min。

1.3.7 细胞核染色 用1×PBS按照一定比例稀释DAPI，每孔加入600 μL染核液，避光染核5 min，荧光显微镜下观察染色定位情况，并拍照保存。

1.4 对比实验

在做FISH之前将玻片分别泡在含0.1、0.2、0.4 mg/mL RNase A的PBS溶液中，于37℃充分消化过夜，之后用4%多聚甲醛固定，脱水杂交处理，与不加RNase A的样品对比，观察样品经RNase A消化后对端粒杂交效果的影响，核仁有无杂交信号。

同时对HeLa、293T和U2OS细胞系经0.4 mg/mL RNase A处理后的端粒FISH结果进行分析，观察端粒杂交效果。

2 结果

端粒蛋白复合体（shelterin）在维持基因组稳定中发挥重要作用，我们用HepG2细胞研究复合体蛋白TRF2在端粒中的定位时，发现IF-FISH实验结果中端粒的图像总是受核仁染色的影响，甚至影响了端粒foci的形成，干扰实验结果分析。核仁的主要成分是细胞核RNA，因此我们试想用RNase A对核仁进行消化，以减少核仁对实验的影响。我们选取了3个浓度的RNase A，在IF反应结束后将细胞放在含RNase A的PBS中于37℃过夜，然后再进行FISH，之后分别检测端粒染色情况和待测蛋白的定位情况。在不加RNase A的端粒免疫荧光图片中（图1），细胞核内的核仁非常明显，加了0.1和0.2 mg/mL RNase A的细胞核内的核仁有所减弱，但还不能完全消除；在使用0.4 mg/mL RNase A消化后，核仁基本没有着色。初步说明IF后加入0.4 mg/mL RNase A可有效降低细胞核中RNA的干扰，获得较清晰的端粒图像，为下一步实验提供可靠的数据。

为了证实这种方法的可行性，我们同时选取了另外3种细胞系来研究RNase A对端粒FISH的影响，结果见图2，可见不同细胞系经0.4 mg/mL RNase A处理后均能得到较清晰的端粒图像，证明此方法是可行的。

图1 HepG2细胞经RNase A消化前后荧光原位杂交效果对比

图2 不同细胞系端粒原位杂交结果

3 讨论

相关研究表明端粒的主要生物学功能是保护染色体末端，避免染色体末端的降解和端-端融合，对维持基因组结构的完整性和稳定性也起到至关重要的作用。免疫荧光及荧光原位杂交技术在实验室多项研究中广泛应用[5]，是研究核蛋白定位的手段。我们在探讨端粒相关蛋白的功能时需要检测端粒蛋白的定位情况，但实验结果总会受核仁的影响，不能得到清晰的端粒原位杂交位点图像。在肿瘤细胞中，蛋白质合成旺盛，核仁较大，而核仁是真核细胞间期核中最明显的结构，所有真核生物的核糖体RNA（rRNA）的转录都是在核仁中完成的。又由于端粒探针的长度较短，在做端粒原位杂交实验时，端粒探针在对端粒进行杂交的同时会与核仁中的RNA有不同程度的结合，进而干扰细胞端粒染色效率。由于待检测目标蛋白表达较强，不会受探针杂交影响，因此我们在目标蛋白免疫荧光反应之后、杂交之前用0.4 mg/mL的RNase A于37℃对不同细胞系进行消化过夜，然后再进行杂交，有效地解决了核仁对实验结果的影响，同时并不影响目标蛋白的结合。在正常细胞中此方法也得到了验证。综上，在端粒FISH实验中加入一定浓度的RNase A可以提高端粒免疫荧光的特异性，得到清晰的端粒FISH图像。

[1]Marsh T C Vesenka J,Henderson E.A new DNA na⁃no-structure,the G-wire,imaged by scanning probe microscopy[J].Nucleic Acids Res,1995,23(4):696-700.

[2]Zhou S.Introduction to telomeres and telomerease[J].Methods Mol Biol,2017,1587:1-13.

[3]Maiti S N.Measurement of average telomere length in ex vivo expanded natural killer cells by fluorescence in situ hybridization(FISH)and flow cytometry[J].Meth⁃ods Mol Biol,2016,1441:57-63.

[4]Ourliac-Garnier I, Londoño-Vallejo A. Telomere length analysis by quantitative fluorescent in situ hy⁃bridization(Q-FISH)[J].Methods Mol Biol,2011,735:21-31.

[5]Kim K D,Iwasaki O,Noma K.An IF-FISH approach for covisualization of gene loci and nuclear architec⁃ture in fission yeast[J].Methods Enzymol,2016,574:167-180.

Application of RNase A in Telomere IF-FISH Experiment

YU Fang,JIN Rui,HUANG Jun-Jian*
Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100850,China

Objective:To decrease nucleolus coloring in immunofluorescence-fluorescencein situhybridization（IF-FISH） of telomere.Methods:The cells were digested overnight at 37℃ with RNase A at concentration of 0.1,0.2 and 0.4 mg/mL and subjected to telomerein situhybridization.Results:The use of 0.4 mg/mL RNase A eliminates nonspecific binding of HepG2 telomerein situhybridization and ensure the accuracy of the experimen⁃tal results.The same results were also got in HeLa,293T and U2OS cells.Conclusion:In situhybridization of telomere,digesting nucleoli with RNase A can provide a clearer immunofluorescence imaging and specificity.

RNase A;immunofluorescence-fluorescencein situhybridization（IF-FISH）;telomere

Q78

A

1009-0002（2017）05-0681-04

10.3969/j.issn.1009-

*Corresponding author,E-mail:junjianhuangbit@163.com

2017-05-03

于芳（1972- ），女，硕士，实验师，（E-mail）yuf_2013@126.com

黄君健，（E-mail）junjianhuangbit@163.com