猴B病毒抗体ELISA检测试剂盒的制备及准确性评价

叶华虎，陈建宇，2，周小军，王进，代艳艳，法云智，袁菊芳

1.军事医学科学院 实验动物中心，北京 100071；2.内蒙古大学 生命科学学院，内蒙古 呼和浩特 010021

猴B病毒抗体ELISA检测试剂盒的制备及准确性评价

叶华虎1，陈建宇1，2，周小军1，王进1，代艳艳1，法云智1，袁菊芳1

1.军事医学科学院 实验动物中心，北京 100071；2.内蒙古大学 生命科学学院，内蒙古 呼和浩特 010021

目的：以金标准试剂盒为参照，对新研制的猴B病毒抗体ELISA检测试剂盒进行准确性评价，以期为我国实验灵长类动物产业提供优质廉价的检测试剂。方法：利用3个批次共表达猴B病毒gD和gB蛋白的细胞上清分别制备ELISA检测试剂盒，与金标准试剂盒（VRL的ELISA试剂盒）同时对667只食蟹猴血清进行检测，考察新研制剂盒的准确性；然后，挑选强阳性、弱阳性、阴性样品，用另外2个批次ELISA试剂盒检测，考察不同批次试剂盒检测结果的稳定性。结果：金标准试剂盒对667只食蟹猴血清抗体检测结果为阳性280份、阴性387份，而新研制的ELISA试剂盒结果为阳性282份、阴性385份；与金标准相比，阳性样品的符合率为98.93%（277/280），阴性样品的符合率为98.97%（383/387），总体符合率为98.95%（660/667）。对100份强阳性样品、70份弱阳性样品、108份阴性样品及7份差异样品的重复检测表明，除1份弱阳性（金标准为阴性）检测为阴性外，其余样品与前期一致。结论：与金标准相比，新研制的试剂盒具有较高的准确性，可用于猴B病毒抗体的检测。

猴B病毒；ELISA抗体检测试剂盒；准确性

B病毒是以灵长类动物特别是猴为自然宿主的人兽共患病病原，在大部分灵长类动物（如恒河猴、食蟹猴等猕猴属）中，通常不表现临床症状，但人感染后，死亡率超过75%。因此，B病毒是实验灵长类动物质量控制的主要病原，也是影响实验灵长类动物产业的关键因素[1-4]。

B病毒属于疱疹病毒科α疱疹病毒属，与该属其他病毒（如单纯性疱疹病毒，herpes simplex virus，HSV）一样具有嗜神经性。即动物感染后，病毒可逆神经上行，在神经节特别是三叉神经节中潜伏，只有活跃期才在外周组织有病毒颗粒存在。可见，依靠外周组织进行病原学诊断存在较高的漏检率。但B病毒感染后，其抗体在动物体内可维持数年，抗体检测因此成为B病毒防控的最佳手段[5-8]。

当前，B病毒抗体检测试剂首推美国亚特兰大大学病毒研究实验室（Virus Research Laborato⁃ry，VRL）研制的一系列制剂（包括 DIA、ELISA、Western印迹等），被认为是实验灵长类动物检测的国际金标准。国内实验动物界虽然也有B病毒抗体检测试剂研究，但抗原多为与B病毒高度同源的HSV，加之抗体检测易受多种因素（如抗原敏感性不足、蛋白质的非特异性结合等）影响，检测结果与金标准有较大差异[9-10]。

我们前期研究发现，将B病毒gD和gB蛋白在CHO细胞中共表达，细胞上清不需要纯化即可获得良好的检测结果[11]。为此，我们研制了以重组蛋白gD和gB为联合抗原的ELISA检测试剂盒。本实验对新研制的试剂盒进行了准确性评价，旨在为我国实验灵长类动物质量控制提供优质廉价的B病毒抗体检测制剂。

1 材料与方法

1.1 材料

猴血清667份，采自军事医学科学院实验动物中心饲养的食蟹猴种群；CD FortiCHO和CHO CD EfficientFeed B无血清培养基、抗结团剂购于Gibco公司；200 mmol/L谷氨酰胺、青霉素、链霉素购于Hyclone公司；HRP标记的兔抗猴IgG二抗购于Sigma公司；新生小牛血清购于杭州四季青公司；TMB单组分显色液购于湖州英创生物科技公司；ELISA酶标板购于Conning公司；猴B病毒ELISA抗体检测试剂盒购于VRL中国苏州西山生物技术公司。

1.2 重组B病毒gD和gB蛋白的制备

将前期构建的共表达gD和gB蛋白的细胞复苏，在培养瓶中加入无血清培养基（添加1%抗结团剂、1%双抗、终浓度为5 mmol/L的谷氨酰胺），待细胞长到200万/mL左右时，转入摇瓶并添加新鲜培养基，使细胞起始密度为（30万～50万）/mL。先以80～100 r/min的转速培养，每2 d检查细胞密度，当细胞密度达（300万～400万）/mL时，每1～2 d按初始体积的5%加入CHO CD Efficient⁃Feed B浓缩培养基，同时摇床转速逐渐提高到150 r/min，直到细胞活率降到75%左右，停止培养，离心收集细胞上清。重复细胞培养过程，收集3个批次的细胞培养上清。

1.3 ELISA检测试剂盒的制备

将收集到的细胞上清用碳酸盐缓冲液（pH9.6）进行系列梯度稀释，包被ELISA板，每孔100 μL，每个稀释浓度设3个复孔，4℃过夜，同时以前期分装的猴B病毒阳性血清进行ELISA检测，根据稀释孔的吸光度（D）值，确定各批次细胞上清的稀释率。之后，利用细胞上清制备ELISA试剂盒。试剂盒组成见表1。

表1 猴B病毒ELISA抗体检测试剂盒组成

1.4 金标准试剂盒检测

参照试剂盒使用说明。基本过程如下：血清稀释至1/50后加入酶标板，每孔100 μL，37℃温箱孵育30 min；用洗液洗涤3次，每次3 min；每孔加入1∶100稀释的酶标二抗100 μL，37℃温箱孵育30 min；用洗液洗涤3次，每次3 min；每孔加入显色液100 μL，室温（20～25℃）避光放置30 min；加入终止液25 μL。用酶联仪读取D值，测试波长为405 nm，参考波长为490 nm；样品D值≥0.3判定为阳性，＜0.3判定为阴性。

1.5 新研试剂盒的ELISA检测

参照试剂盒使用说明。基本过程如下：将试剂盒室温放置30 min；向每孔中加入1∶9稀释的血清100 μL，37℃温箱孵育30 min；用1×洗液洗涤3次，每次3 min；在吸水纸上拍干，每孔加入酶标二抗工作液100 μL，37℃温箱放置30 min；用1×洗液洗涤3次，每次3 min；在吸水纸上拍干，每孔加入显色液100 μL，37℃温箱放置15 min；加入终止液50 μL。采用双波长测定样品的D值，测量波长为450 nm，参比波长为620 nm。以D值0.2为阈值，≥0.2判定为阳性，＜0.2判定为阴性。

1.6 不同批次ELISA试剂盒的重复性实验

从所测样品中挑选强阳性100份、弱阳性70份、阴性样品108份及差异样品7份，分别用另外2个批次的ELISA试剂盒重复检测，考察不同批次试剂盒的稳定性和重复性。

2 结果

2.1 CHO工程细胞上清收集及ELISA试剂盒制备

分别取3支冻存的CHO工程细胞，复苏后用无血清培养基饲养于方瓶中，待细胞密度为200万/mL左右时，将其放大接种于250 mL摇瓶，使起始密度为（30万～50万）/mL；当细胞密度达到（200万～300万）/mL时，添加 CHO CD Efficient⁃Feed B浓缩培养基，继续培养直到细胞活率约75%左右，停止培养，离心（10 000 r/min）收集细胞上清。3个批次的细胞生长曲线如图1。细胞接种摇瓶后，通常在第4 d进入快速生长期，10～12 d达到最高密度（密度约1300万/mL）；此后，细胞结团现象出现，单细胞密度呈下降态势，并出现较多的死细胞。因此，在接种后14～16 d收集细胞上清。

细胞培养上清用碳酸盐缓冲液稀释，制备ELISA试剂盒，编号分别为2016-4-01、2016-4-02和2016-5-01。

2.2 标准试剂盒的检测结果

利用VRL的ELISA试剂盒，对本单位667只食蟹猴进行检测，按照试剂盒的判定标准，阳性样品280份，阳性率为42.0%；阴性样品387份，阴性率为58.0%。

2.3 新研ELISA试剂盒（2016-4-01）的检测结果

图1 3批工程细胞的生长曲线

同样，用新研试剂盒2016-4-01对667只食蟹猴进行检测，测得阳性样品282份，阴性样品385份。对282个阳性样品进行统计，D值为0.2～0.5、0.5～1.0、1.0～2.0 和＞2.0 的样品数分别为 25、45、182和30；对385个阴性样品进行统计，D值为≤0.08、0.08～0.1和 0.1～0.2的样品数分别为 342、29和14（图2）。总体而言，新研试剂盒阴阳性反差明显，在阈值D为0.2左右的样品数少。

但是，新研试剂盒与标准试剂盒有7份样品的检测结果存在差异。其中标准试剂盒检测中的3份阳性样品在新研试剂盒检测中为阴性；另外4份标准试剂盒检测为阴性的样品，新研试剂盒检测为阳性，尽管其D值相对较低（0.2≤D值≤0.3）。以金标准试剂盒检测结果为参照，新研试剂盒检测阳性样品的符合率为98.93%（277/280），检测阴性样品的符合率为98.97%（383/387），全部样品的符合率为98.95%（660/667）（表2）。

图2 阳性样品和阴性样品的D值分布

表2 新研试剂盒与标准试剂盒的检测结果比较

2.4 不同批次ELISA试剂盒的重复性实验结果

根据上述测试结果，挑选强阳性样品100份、弱阳性样品70份、阴性样品108份、差异样品7份，共285份，分别用2016-4-02和2016-5-01试剂盒进行检测。结果发现，除1份样品（9-10号样品在2016-4-02和2016-5-01中的D值均小于0.2而被判为阴性，且标准试剂盒检测为阴性）由最初的阳性转为阴性外，其余样品检测结果与2016-4-01完全一致。表明新研ELISA试剂盒的稳定性和重复性较好。而9-10号样品由最初的阳性转为阴性结果，可能与血清存放时间有关。

为了进一步明确新研试剂盒之间以及新研试剂盒与金标准之间的差异，同时对7份存在差异的血清样品进行测试，结果见表3。3批次新研试剂盒总体稳定，所有样品D值的变异系数不超过12%。此外，比较发现，VRL试剂盒测试的4-18、7-1和11-2号样品均为阳性，而新研试剂盒3个批次均为阴性；而1-2和3-43号样品在VRL测试中均为阴性，但新研试剂盒全为阳性。其原因尚不清，可能与ELISA的阈值设定有关，因为在两类试剂盒中，3个样品的D值都接近于阈值。

表3 差异样品在不同试剂盒中的检测结果（D值）

3 讨论

作为与人类亲缘最近的物种，非人灵长类动物在生命科学研究中具有明显的比较优势。随着蛋白类药物、疫苗等生物制品研发进度的加快，以及脑科学在全球主要国家的相继推出，非人灵长类动物已成为不可或缺的实验动物[12-13]。然而，以非人灵长类动物（特别是猴）为自然宿主的B病毒，因在猴群中的高感染率（30%～80%）和对人的高致死率（超过75%），受到包括实验灵长类动物产业界和从事灵长类动物实验科研人员的广泛关注。

由于B病毒的潜伏性（可终生潜伏于三叉神经节）和不定期活化等特征，以及全球尚无疫苗等现实，抗体检测成为实验灵长类动物质量控制的主要甚至是惟一手段。而在抗体检测的核心试剂——抗原的选择上，既有以B病毒（或裂解蛋白）作为抗原的报道，也有以其他同源病毒如HSV、猴因子8（simian agent 8，SA8）为抗原的研究报道[9，14-15]，导致结果也存在较大差异。近年来，随着重组技术的不断进步，筛选B病毒的重要免疫分子研制亚单位疫苗和/或抗体检测制剂已悄然兴起。Perelygina比较了B病毒gB、gC、gD、gG等分子的检测效果，敏感性为gB＞gD＞gC＞gG，特异性正好相反[16]。而Fujima研究认为，B病毒的gD分子不仅敏感性高，而且特异性好，甚至能有效鉴别疱疹病毒属的其他成员[17]。尽管如此，获得实验灵长类动物业界认可且以重组蛋白为抗原的B病毒抗体检测试剂尚未见报道。美国亚特兰大大学VRL研制的以B病毒为抗原的检测制剂仍然是目前公认的国际金标准。但是，由于猴B病毒属于生物安全4级病原，病毒操作不仅需要严格的防护条件，而且需要专业化培训，对于大多数研究者来说遥不可及。我们前期研究发现，利用细胞共表达B病毒的gD和gB蛋白，能有效提高B病毒抗体检测的敏感性。为此，我们在对ELISA体系进行优化（筛选更有利的酶标板封闭、酶标二抗浓度、洗液等）的基础上，研制了以重组蛋白gD和gB为抗原的猴B病毒ELISA抗体检测试剂盒。

与金标准试剂盒相比，新研试剂盒测定在阳性样品中的符合率为98.9%（277/280），阴性样品为99.0%（383/387），全部667份样品的符合率为99.0%（660/667）。尽管二者非常一致，但必须看到，金标准试剂盒测得的4份阴性样品在新研试剂盒检测中为阳性，而金标准试剂盒测得的3份阳性样品在新研试剂盒检测中为阴性。我们认为差异原因可能有以下三种：一是gB和gD并非病毒感染后刺激机体产生免疫应答最早最强的分子，或者是二者的抗体在体内代谢较快，导致新研试剂盒出现假阴性；二是金标准试剂盒以B病毒为抗原，而该病毒分子成分复杂，既可能导致ELISA板孔结合最强抗原（如gB和gD）的量相对较少，也可能与其他异源分子（相对于动物机体）存在较高的同源性，致使敏感性和特异性稍显不足；三是与判定标准有关，在间接ELISA判定标准上，既可以阴性样品的平均值+2SD（置信区间为95%），也可以阴性样品的平均值+3SD（置信区间为99%），而7个差异样品的D值均接近于阈值，判定标准设置的严格程度也会对结果产生微妙影响。

值得注意的是，新研试剂盒由于在ELISA体系上进行了整体优化而表现出两个特征：一是阴阳性样品的D值反差非常明显，282份阳性样品中D值为0.2～0.5的只有25份（8.9%），而387份阴性样品中D值为0.1～0.2的仅有14份（3.6%）；二是新研试剂盒批次之间重复性好，用3批培养的细胞上清分别制备试剂盒，结果几乎完全一致，7份差异样品批次之间的D值差异小于12%。

综上，我们利用B病毒重组蛋白gD和gB制备的抗体ELISA检测试剂盒与金标准的符合率约为99%。同时，由于直接利用细胞上清进行包被而不需要蛋白纯化，有效降低了试剂盒成本，可望为我国实验灵长类动物产业提供准确廉价的B病毒抗体检测试剂。

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Preparation an Accuracy Evaluation of ELISA Kitfor Monkey B Virus Antibody

YE Hua-Hu1,CHEN Jian-Yu1,2,ZHOU Xiao-Jun1,WANG Jin1,DAI Yan-Yan1,FA Yun-Zhi1,YUAN Ju-Fang1*
1.Laboratory Animal Center,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100071;2.College of Life Sciences,Inner Mongolia University,Hohhot 010021;China

Objective:In order to provide a kind of high quality and low-cost detection reagents for experimen⁃tal primates industry,the accuracy of the newly developed B virus antibody ELISA test kits was evaluated with the gold standard kit as the reference.Methods:Three batches of cell supernatants co-expressing monkey B virus gD and gB protein were used to prepare ELISA kits for B virus antibodies test.Then,667 cynomolgus monkeys sera were detected simultaneously by gold standard kits（VRL ELISA kits） and new kits to investigate its accura⁃cy.Finally,strong positive,weak positive and negative samples were selected and tested by the other two batches of ELISA kits to examine the stability in different kits.Results:In 667 cynomolgus monkey sera samples,positivesamples and negative samples were 280 and 385 respectively,detected in gold standard kits.The corresponding re⁃sults were 282 and 387 in new ELISA kits.In positive samples,negative samples and all the samples,the coinci⁃dence rate was 98.93%（277/280）,98.97%（383/387）and 98.95%（660/667）,respectively,compared with gold stan⁃dard kits.Then,100 strong positive samples,70 weakly positive samples,108 negative samples and 7 differential samples,according to the OD values,were screened and tested with the other two batches of ELISA kits.Except for one weakly positive sample（negative in gold standard kits） tuned into negative,other samples were consistent with the previously tested.Conclusion:Compared with the gold standard ELISA kits,the newly developed kits have high accuracy,could be used for the detection of monkey B virus antibody.

monkey B virus;ELISA antibody detection kit;accuracy

R392.1

A

1009-0002（2017）05-0651-06

10.3969/j.issn.1009-

*Corresponding author,E-mail:yjf1014@tom.com

2017-02-09

国家支撑计划（2015BAI08B03）；国家自然科学基金（31272514，31501908）

叶华虎（1970- ），男，博士，（E-mail）huahuy512@126.com

袁菊芳，（E-mail）yjf1014@tom.com