Runx2真核表达载体的构建及其对骨肉瘤细胞增殖的影响

代建宁，邓彩霞，景调平，姥伟，杨海旭

解放军第五医院 a.骨科中心；b.高压氧；c.麻醉手术科；宁夏 银川 750004

Runx2真核表达载体的构建及其对骨肉瘤细胞增殖的影响

代建宁a，邓彩霞b，景调平c，姥伟a，杨海旭a

解放军第五医院 a.骨科中心；b.高压氧；c.麻醉手术科；宁夏 银川 750004

目的：构建人源Runx2过表达重组载体，探讨Runx2对骨肉瘤细胞增殖能力的影响。方法：以HEK293细胞总RNA为模板，反转录为cDNA，通过PCR技术扩增Runx2全长基因并连接至真核表达质粒pcDNA3.1，筛选阳性克隆进行序列测定后，转染至骨肉瘤细胞Saos-2和U2-OS，通过MTT实验验证Runx2调节细胞增殖的能力。结果：构建了pcDNA3.1-Runx2真核表达载体，并在骨肉瘤细胞Saos-2和U2-OS中高表达Runx2蛋白；Runx2高表达后，骨肉瘤细胞增殖能力显著增加。结论：构建了Runx2基因高效真核表达载体，并证明Runx2可以促进骨肉瘤细胞的增殖。

Runx2；真核表达载体；骨肉瘤细胞；细胞增殖

骨肉瘤严重威胁着人们健康，高发于青少年人群，位列青少年肿瘤第三位，仅次于淋巴瘤和脑肿瘤[1]。根据其组织成分，可将骨肉瘤的亚型分为成骨细胞型、成软骨细胞型、成纤维细胞型、成韧带型和小细胞型。深入探讨其发生机制，对于骨肉瘤的诊断和治疗均具有重要意义。Runx2（Runt-related transcription factor 2）是 Runt相关转录因子家族成员。前期研究表明，Runx2在成骨分化的信号途径中发挥重要作用，能诱导间充质干细胞向成骨细胞定向分化和成熟，促进骨组织的发育和伤口愈合[2-3]。本研究中，我们构建了Runx2的高效真核表达载体，并验证了其对骨肉瘤细胞增殖能力的影响，为后续研究Runx2在骨肉瘤细胞发生发展中的作用打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

HEK293细胞、骨肉瘤细胞系Saos-2和U2-OS购自中国科学院细胞库；大肠杆菌TOP10、限制性内切酶及连接酶购自TaKaRa公司；pcDNA3.1真核表达质粒和脂质体2000购自Invitrogen公司；抗体 Runx2购自 Cell Signaling Technology（CST）公司；β-actin购自博士德公司。

1.2 pcDNA3.1-Runx2真核表达载体的构建

提取HEK293细胞总RNA并反转录成cDNA，根据Runx2的编码序列设计引物，通过反转录PCR扩增Runx2的mRNA。上游引物序列为5'-GATATCATGGTGGCCGGGACCCGC-3'，酶 切 位 点为EcoRⅤ；下游引物序列为5'-CTCGAGTCAATA TGGTCGCCAAAC-3'，酶切位点为XhoⅠ。PCR反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸90 s，重复35个循环；72℃充分延伸30 min。经DNA电泳证明序列位置正确后，回收PCR产物，用EcoRⅤ和XhoⅠ对pcDNA3.1和Runx2扩增产物双酶切，经连接、转化实验后，挑取阳性克隆进行酶切鉴定和DNA测序。

1.3 pcDNA3.1-Runx2转染骨肉瘤细胞

分别将5×105骨肉瘤细胞Saos-2和U2-OS接种至6孔板，待细胞密度长至约60%时进行转染。将pcDNA3.1（阴性对照）或pcDNA3.1-Runx2质粒4 μg、脂质体2000 10 μL在400 μL无血清培养液中混匀，转染至细胞。转染一定时间后进行后续实验。

1.4 Western印迹实验

转染48 h后分别收取阴性对照pcDNA3.1、过表达pcDNA3.1-Runx2的骨肉瘤细胞Saos-2和U2-OS，用预冷的PBS溶液洗涤3次，加入RIPA蛋白裂解液，超声波裂解细胞提取蛋白；离心后，收取蛋白上清，通过BCA定量法对各组蛋白进行定量；按照一定体积加入5×上样缓冲液，于沸水中10 min，保证蛋白充分变性；取30 μg蛋白样品进行蛋白电泳实验（SDS-PAGE），浓缩胶电压为120 V，分离胶电压为160 V；电泳毕，将凝胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜（NC膜）上，用5%脱脂奶粉封闭1 h；分别用Runx2抗体（1∶5000稀释）和β-actin抗体（1∶500稀释）与NC膜于4℃孵育过夜，次日用含0.5%Tween-20的TBST洗3次，5 min/次，再加入相应结合的二抗后，与ECL发光检测剂结合显示结果。

1.5 MTT法检测细胞活力

阴性对照pcDNA3.1、过表达pcDNA3.1-Runx2的骨肉瘤细胞Saos-2和U2-OS转染24 h后，将各组细胞用含10%血清的培养液制成单个细胞悬液，以104/孔接种到96孔板，每孔体积200 μL；分别在培养0、24、48、72 h后进行MTT实验（每孔加入5 mg/mL的MTT溶液，孵育4 h后终止培养，小心吸弃上清液，每孔加入100 μL DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解）；在酶联免疫检测仪上测定各孔的D490nm值，以时间为横坐标、D490nm值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

2 结果

2.1 pcDNA3.1-Runx2重组质粒的构建和鉴定

以HEK293细胞的cDNA作为模板，经PCR反应扩增出Runx2编码区域，条带位置为1000～2000 bp，与Runx2全长（1566 bp）相符（图1）。将Runx2和pcDNA3.1分别用EcoRⅤ和XhoⅠ双酶切后连接转化大肠杆菌感受态TOP10，挑取克隆提取质粒并进行酶切鉴定。经EcoRⅤ和XhoⅠ双酶切鉴定，发现1～4号克隆均可在1000～2000 bp位置切得条带，经测序鉴定正确后进行后续实验（图2）。

2.2 pcDNA3.1-Runx2转染骨肉瘤细胞后高表达Runx2蛋白

为了验证Runx2是否能在真核细胞中正确转录和翻译，将pcDNA3.1-Runx2质粒和阴性对照pcDNA3.1空载体瞬时转染骨肉瘤细胞Saos-2和U2-OS。Western印迹实验发现，与阴性对照相比，转染pcDNA3.1-Runx2质粒的细胞中Runx2蛋白水平显著升高，这表明pcDNA3.1-Runx2质粒能在真核细胞中表达（图3）。

图1 Runx2基因PCR产物电泳图谱

图2 重组质粒pcDNA3.1-Runx2的EcoRⅤ/XhoⅠ双酶切电泳图谱

图3 Western印迹检测Runx2在各细胞中的蛋白表达

2.3 Runx2促进了骨肉瘤细胞的增殖能力

我们分析了Runx2是否对骨肉瘤细胞Saos-2和U2-OS的增殖具有调控作用。分别选择不同时间点（0、24、48、72 h）进行MTT实验，发现转染pcDNA3.1-Runx2质粒的细胞增殖能力显著高于阴性对照细胞，差异具有统计学意义（P＜0.001）（图4）。这一结果说明，Runx2可以在骨肉瘤细胞Saos-2和U2-OS中促进细胞的增殖。

图4 MTT法检测骨肉瘤细胞生长曲线

3 讨论

Runx2是细胞内重要的转录因子，属于Runt相关转录因子家族，包含Runt DNA结合结构域。以往研究显示，Runx2对成骨细胞的分化和骨骼形态发生至关重要，是间充质干细胞向成骨细胞分化的特异性转录调节因子，通过调控骨骼发育相关基因的表达发挥功能[4-5]。高表达的Runx2是成骨细胞初始分化的标志，它也是骨形成过程中最早和最具特异性的标志基因。在生物进化过程中，Runx2基因高度保守，当Runx2基因表达缺失时将导致骨发育不良或终止[6]。此外，Runx2还参与了多种信号转导途径，可以受到骨形态发生蛋白、胰岛素样生长因子、甲状腺激素、成纤维细胞生长因子等多种因素的影响，对成骨细胞和破骨细胞均有效应，在骨代谢过程中发挥着关键作用[7-9]。

Runx2与多种肿瘤的发生发展密切相关。在乳腺癌中，Runx2高表达可以促进MMP-13、MMP-9、VEGF等转移相关基因的表达，促进细胞的侵袭和迁移能力[10-11]；在前列腺癌中，Runx2的过表达会上调Sox9、Snail2等转录因子的表达，诱导细胞上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transi⁃tion，EMT）过程的发生[12-13]；在肝癌中，Runx2通过直接结合长链非编码RNA MT1DP启动子，抑制其表达并促进肝癌细胞的增殖[14]；在结肠癌中，Runx2可以与ETS-1结合，促进迁移相关基因的表达，促进肿瘤侵袭和转移过程[15]。

本研究中，我们以骨肉瘤细胞系作为研究模型，通过重组DNA技术构建了pcDNA3.1-Runx2真核表达载体，并发现pcDNA3.1-Runx2可以在Saos-2和U2-OS细胞中诱发Runx2蛋白的高表达，功能实验进一步证实Runx2的高表达会显著促进骨肉瘤细胞的增殖能力。这一研究为后续探讨Runx2在骨肉瘤细胞中促增殖的功能及相关机制打下了基础。

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Construction of RunX2 Expression Plasmid and its Promo⁃tive Role on Osteosarcoma Cell Proliferation

DAI Jian-Ninga,DENG Cai-Xiab,JING Diao-Pingc,LAO Weia*,YANG Hai-Xua*
a.Department of Orthopedics;b.Department of Hyperbaric Oxygen;c.Department of Anesthesiology;the 5th Hos⁃pital of PLA,Yinchuan 750004,China

Objective:To investigate the effect of Runx2 on the osteosarcoma cells proliferation.Methods:The total RNA was extracted from HEK293 cells,from which the Runx2 full length cDNA was amplified through RTPCR,and itwas cloned into pcDNA3.1 vector.The positive plasmid wasselected and transfected into osteosarcoma cells Saos-2 and U2-OS,and biological function of Runx2 was examined through MTT assay.Results:We constructed Runx2 expression plasmid,and confirmed the highly expression ofRunx2 after transfection of pcDNA3.1-Runx2 in Saos-2 and U2-OS cells.Runx2 over-expression induced cell proliferation.Conclusion:Runx2 can accelerate osteosarcoma cell proliferation.

Runx2;mammal expression vector;osteosarcoma cells;cell proliferation

Q78;Q25

A

1009-0002（2017）05-0643-04

10.3969/j.issn.1009-

*Co-corresponding authors,LAO Wei,E-mail:mulaowei@126.com;YANG Hai-Xu,E-mail:bioyhx@126.com

2017-01-12

代建宁（1978- ），男，本科学历，主治医师

姥伟，（E-mail）mulaowei@126.com；杨海旭，（E-mail）bioyhx@126.com