pH值和剂量对腹腔注射L-精氨酸诱导小鼠急性胰腺炎模型的影响

肖鲁瑶 张 杰* 郑 帅 梅少帅

(1.首都医科大学附属北京安贞医院消化内科，北京 100029；2.首都医科大学附属北京安贞医院心肺血管疾病研究所，北京 100029；3.首都医科大学附属北京安贞医院病理科，北京 100029)

·基础研究·

pH值和剂量对腹腔注射L-精氨酸诱导小鼠急性胰腺炎模型的影响

肖鲁瑶1张 杰1*郑 帅2梅少帅3

(1.首都医科大学附属北京安贞医院消化内科，北京 100029；2.首都医科大学附属北京安贞医院心肺血管疾病研究所，北京 100029；3.首都医科大学附属北京安贞医院病理科，北京 100029)

目的探讨L-精氨酸(L-arginine)不同给药方法诱导小鼠急性胰腺炎模型的效果。方法L-精氨酸溶液以不同pH值、不同剂量诱导小鼠急性胰腺炎模型，造模后2、4、12、24 h统计小鼠病死率，采集小鼠血浆以淀粉-碘比色法检测淀粉酶活性，取胰腺及肺组织行石蜡切片HE染色观察组织损伤严重程度。结果pH值为11高剂量组小鼠2 h病死率100%，其余各组各时间点小鼠均存活。3个模型组与对照组相比血浆淀粉酶活性、胰腺组织病理评分均升高，差异有统计学意义(P<0.05)。模型组之间比较，pH值为7高剂量组胰腺及肺组织损伤最重。结论L-精氨酸溶液的 pH值及给药剂量对胰腺损伤程度有不同程度的影响，20%L-精氨酸溶液pH值为7按4 g/kg的剂量间隔1 h连续2次腹腔注射诱导的小鼠急性胰腺炎模型组织损伤重，且小鼠存活率高。

小鼠；L-精氨酸；急性胰腺炎；动物模型

急性胰腺炎是临床常见病，急性重症胰腺炎病情进展快，病死率高[1]。动物模型是研究其病理机制、治疗疗效的重要途径。小鼠急性胰腺炎模型的建立方法很多，药物腹腔注射的方法具有操作简单、降低感染风险、对内环境影响小等优势，应用L-精氨酸腹腔注射是诱导小鼠急性胰腺炎的重要造模方法之一。大多数研究采用间隔1 h连续两次腹腔注射给药的方式[2-4]，但不同文献对L-精氨酸溶液的单次给药剂量及溶液pH值报道并不统一[5-7]。为了找到最佳造模条件，本研究对比了L-精氨酸溶液不同pH值、不同剂量的给药方案所诱导小鼠急性胰腺炎模型的效果。

1 材料与方法

1.1材料

1)动物：健康C57BL/6J雄性小鼠102只，体质量20～25 g，SPF级，购自北京华阜康生物科技有限公司，实验动物许可证号：11401500012660。

2)仪器与试剂：高精度电子天平(瑞士Mettler公司)，高速低温离心机(美国Thermo公司)，Biotek Synergy4全波长多功能酶标仪(美国Gene公司)，Eclipse TE2000-S显微镜(日本Nikon公司)，PB-10 pH计(德国Sartorius公司)。L-精氨酸(L-arginine, L-Arg)(Solarbio，货号A0013)纯度≥98%，使用时用0.9%(质量分数)氯化钠注射液配成20%(质量分数)溶液，pH值计测定溶液pH值，盐酸溶液调节pH值。α-淀粉酶 (amylase, AMS) 试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号C016)，其余试剂均为国产分析纯级。

1.2实验方法

1.2.1 分组

C57BL/6J小鼠102只,采用数字表法随机分为5组: pH值为7低剂量组24只、pH值为7高剂量组24只、pH值为11低剂量组24只、pH值为11高剂量组24只及对照组6只。

1.2.2 实验方法

实验前各组小鼠禁食12 h、不禁水，各模型组以不同pH值、不同剂量L-精氨酸溶液间隔1 h连续2次小鼠腹腔注射，详见表1。对照组用等体积0.9%(质量分数)氯化钠注射液间隔 1 h连续 2次腹腔内注射。各模型组均在第2次腹腔注射给药后2、4、12、24 h 4个时间点观察小鼠血浆淀粉酶活性、胰腺及肺组织病理，并统计小鼠病死率，每个时间点6只小鼠；对照组第2次腹腔注射给药后12 h观察上述指标。

表1 各模型组L-精氨酸给药方法Tab.1 Injection methods of L-arginine in model groups

1.2.3 标本收集及处理

在2、4、12、24 h以1%(质量分数)戊巴比妥钠0.009 mL/g麻醉小鼠，右心房取血于肝素钠抗凝的EP管，立即低温离心3 000 r/min 15 min，分离血浆，淀粉-碘比色法检测血浆淀粉酶活性；留取胰腺及肺组织浸于4%(质量分数)多聚甲醛溶液中固定24 h，经过脱水、石蜡包埋后切片并 HE染色，请专业人员进行病理分析。采用胰腺组织病理Rongione评分指标[8]。

1.3统计学方法

2 结果

2.1各模型组成功构建急性胰腺炎模型

pH值为11高剂量组小鼠2 h病死率为100%，其余3个模型组各观察时间点小鼠均存活。造模后12 h，模型组与对照组相比，小鼠血淀粉酶活性、胰腺组织病理Rongione评分均升高，且差异有统计学意义(P<0.05)，3个模型组均成功构建急性胰腺炎模型(图1)。

2.2各模型组胰腺炎程度随时间变化

各模型组在造模后2、4、12、24 h观察血淀粉酶活性和胰腺组织病理评分变化。pH值为7低剂量组小鼠造模后4 h血淀粉酶活性开始升高，12 h达到高峰，24 h后开始回落，而pH值为7高剂量组及pH值为11低剂量组小鼠造模后2 h血淀粉酶活性开始升高，同样12 h达高峰，24 h回落；各模型组胰腺组织病理评分在2 h开始升高，12 h达到高峰，24 h开始下降(图2)。

2.3各模型组急性胰腺炎严重程度比较

比较各模型组在造模后12 h血淀粉酶活性，由高到低依次为pH值为7高剂量组(14 579±1 267)U/dL、pH值为11低剂量组(8 179±1 167)U/dL、pH值为7低剂量组(4 657±349.5)U/dL(图2A)；各模型组造模后12 h胰腺组织石蜡切片HE染色，pH值为7低剂量组可见局灶腺泡细胞空泡变性，叶间水肿，未见明显炎细胞浸润、腺泡细胞坏死；pH值为7高剂量组可见叶间水肿，扩散性腺泡细胞空泡变性，小叶边缘大量炎细胞浸润、腺泡细胞坏死、核固缩；pH值为11低剂量组可见扩散性腺泡细胞空泡变性，叶间水肿，未见明显炎细胞浸润及腺泡细胞坏死；肺组织石蜡切片HE染色，各模型组肺组织肺泡壁增厚，肺泡上皮增生，炎细胞浸润，其中pH值为7高剂量组最为明显，肺组织结构明显紊乱(图3)。

图1 不同模型组造模后12 h诱导的小鼠急性胰腺炎效果评价Fig.1 Evaluation of mice acute pancreatitis 12 h after last injection in different model conditions

A： plasma amylase activity;B: Rongione score of pancreas pathological indicators;n=6，**P<0.01vscontrol group,***P=0.000vscontrol group.

图2 各模型组急性胰腺炎程度随时间变化Fig.2 Time dependent changes of mice acute pancreatitis severity in different model conditionsA: plasma amylase activity; B: Rongione score of pancreas pathological indicators(,n=6).

3 讨论

L-精氨酸1984年首次用于诱导急性胰腺炎模型[9]，大剂量 L-精氨酸溶液能减少多胺合成从而抑制细胞核酸及蛋白质合成，而胰腺腺泡细胞的蛋白质合成最为活跃，因此出现损伤[10]。目前L-精氨酸用于诱导小鼠急性胰腺炎模型的给药方案在不同文献报道不一，L-精氨酸溶液浓度、pH值、给药剂量影响造模效果[11-14]。使用8%(质量分数)L-精氨酸溶液诱导模型使小鼠液体负荷增加，可能增加小鼠病死率，20%(质量分数)L-精氨酸溶液可明显减低小鼠液体负荷。由于L-精氨酸溶液强碱性(pH值为11)的特点，对腹腔具有较强的化学刺激作用，使得小鼠急性胰腺炎模型不稳定，增加小鼠病死率，石占利等[15]比较了不同pH的L-精氨酸溶液所诱导小鼠急性胰腺炎模型效果，pH值为11时胰腺损伤较pH为8时严重，小鼠病死率增加；调整L-精氨酸溶液pH值后小鼠存活率增加，但胰腺组织损伤减轻。此外不同给药剂量也影响胰腺组织损伤效果[16]。本研究比较L-精氨酸两种不同pH值及不同给药剂量诱导的小鼠急性胰腺炎模型效果，结果显示，不调节L-精氨酸溶液pH值的情况下，高剂量给药方案小鼠病死率高，不适合用于造模；而低剂量给药方案小鼠胰腺组织主要表现扩散性腺泡细胞空泡变性及胰腺组织叶间水肿，炎细胞浸润、腺泡细胞坏死不明显，血淀粉酶水平较对照组升高2倍余；调整L-精氨酸溶液pH值至7，小鼠存活率提高，低剂量给药方案小鼠胰腺表现局灶腺泡细胞空泡变性，叶间水肿，血淀粉酶水平较对照组升高不到2倍，胰腺炎性反应相对轻；提高给药剂量后胰腺组织损伤明显加重，表现叶间水肿，扩散性腺泡细胞空泡变性，小叶边缘大量炎细胞浸润、腺泡细胞坏死、核固缩，血淀粉酶水平较对照组升高达3倍以上，胰腺炎性反应明显加重。由此可见，调整精氨酸溶液pH值后增加给药剂量所诱导的小鼠急性胰腺炎模型胰腺组织损伤最重。同时，不同给药方案肺组织病理改变与胰腺组织病理改变具有一致性，pH值为7高剂量组小鼠肺组织损伤最重，可用于急性胰腺炎肺损伤相关研究。

综上所述，L-精氨酸可以诱导小鼠急性胰腺炎模型，但不同的给药方案诱导的小鼠急性胰腺炎模型胰腺组织损伤效果不同，甚至导致小鼠病死率不同。本研究对比4种给药方案，20%(质量分数)L-精氨酸调整pH值为7后以4 g/kg间隔1 h连续2次腹腔注射的给药方案诱导小鼠急性胰腺炎可以达到满意效果，胰腺组织出现水肿、炎细胞浸润、空泡变性、坏死，且小鼠存活率100%，能较好满足科研需求。

[1] Tenner S, Baillie J, Dewitt J, et al. American college of gastroenterology guideline: management of acute pancreatitis.[J]. Am J Gastroenterol, 2014, 109(2):302-302.

[2] Hongwei Z, Xiao Y, Shaihong Z, et al. The fusion of autophagosome with lysosome is impaired in L-arginine-induced acute pancreatitis[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(9):11164-11170.

[3] Aziz N M, Kamel M Y, Rifaai R A. Effects of hemin, a heme oxygenase-1 inducer in L-arginine-induced acute pancreatitis and associated lung injury in adult male albino rats.[J]. Endocrine Regulat, 2017, 51(1):20-30.

[4] 张晓芹, 贾晓云, 李涛,等. 清胰汤对L-精氨酸诱发的重症急性胰腺炎小鼠胰腺p-STAT3表达的影响[J]. 中国病理生理杂志, 2011, 27(11):2175-2179.

[5] Qiao Y Y, Liu X U, Xu CQ, et al. Interleukin-22 ameliorates acute severe pancreatitisassociated lung injury in mice[J]. World J Gastroenterol, 2016, 22(21):5023-5032.

[6] Chen J, Cai Q P, Shen P J, et al. Netrin-1 protects against L-Arginine-induced acute pancreatitis in mice[J]. PLoS One, 2012,7(9):1-9.

[7] Merza M, Hartman H, Rahman M, et al. NeutropHil extracellular traps induce trypsin activation, inflammation, and tissue damage in mice with severe acute pancreatitis[J]. Gastroenterology, 2015,149(7):1920-1931.

[8] Yu Q H, Guo J F, Chen Y, et al. Captopril pretreatment protects the lung against severe acute pancreatitis induced injury via inhibiting angiotensin II production and suppressing Rho/ROCK pathway[J]. Kaohsiung J Med Sci, 2016, 32(9):439-445.

[9] Mizunuma T, Kawamura S, Kishino Y. Effects of injecting excess arginine on rat pancreas[J]. J Nutr, 1984, 114(3):467-471.

[10] Tani S, Itoh H, Okabayashi Y, et al. New model of acute necrotizing pancreatitis induced by excessive doses of arginine in rats[J]. Dig Dis Sci, 1990,35(3):367-374.

[11] Bettaieb A, Koike S, Chahed S, et al. Pancreatic protein tyrosine pHospHatase 1B deficiency exacerbates acute pancreatitis in mice[J]. Am J Pathol, 2016,186( 8):2043-2054.

[12] Yu L, Yang M, Liu J, et al. Recombinant Reg3α protein protects against experimental acute pancreatitis in mice[J]. Mol Cell Endocrinol, 2016,422:150-159.

[13] Zhu H, Huang L, Zhu S, et al. Regulation of autopHagy by systemic admission of microRNA-141 to target HMGB1 in l-arginine-induced acute pancreatitisinvivo[J]. Pancreatology, 2016,16(3):337-346.

[14] 魏国丽, 郑学宝, 刘强, 等. 腹腔内注射L-精氨酸诱导法建立急性胰腺炎小鼠模型的评价[J]. 中国实验诊断学, 2011,15(10):1631-1634.

[15] 石占利, 陈芝芸, 高凯. 不同pH值L-精氨酸诱导小鼠急性胰腺炎模型效果观察[J]. 浙江中西医结合杂志, 2013,23(4):265-268.

[16] 程礼, 胡国勇, 韩伟, 等. 左旋盐酸精氨酸诱导重症急性胰腺炎模型的建议[J]. 胃肠病学和肝病学杂志, 2009,18(5):459-462.

EffectsofpHvaluesanddosesonintraperitonealinjectionofL-arginineinducedacutepancreatitisinmice

Xiao Luyao1, Zhang Jie1*, Zheng Shuai2, Mei Shaoshuai3

(1.DepartmentofGastroenterology,BeijingAnzhenHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100029,China; 2.BeijingInstituteofHeartLungandBloodVesselDiseases,BeijingAnzhenHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100029,China; 3.DepartmentofPathology,BeijingAnzhenHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100029,China)

ObjectiveTo investigate the effects of different methods of L-arginine injection on acute pancreatitis model mice.MethodsMice suffering from acute pancreatitis were induced by different pH values and different doses of L-arginine, then mortality was calculated, and plasma amylase activity was detected by starch-iodine colorimetry, and pancreas and lung tissue injury severity was observed by paraffin section of HE staining at the time of 2, 4, 12, 24 h after last injection.ResultsMortality in pH11 high-dose group was 100% at 2 h, and mice in other groups all survived. Compared with the control group, the plasma amylase activity and pancreas pathological score were significantly increased in all model groups (P<0.001).Compared with the other model groups, pancreas and lung tissue injury was the most severe in pH7 high-dose group.ConclusionThe pH value and dosage of L-arginine solution have significant impacts on the degree of pancreatic injury. Acute pancreatitis mice model induced by 2 i.p. injections of L-arginine (400 mg/kg body weight) in 0.9% sodium chloride (pH7) at 1-hour intervals was the most severe compared with the other model groups, and with high survival rate.

mice; L-arginine; acute pancreatitis; animal model

国家自然科学基金 (81470889)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China(81470889).

*Corresponding author， E-mail：zhangjie4155@sina.com

时间：2017-10-14 16∶06

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20171014.1606.014.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.05.014]

R576

2017-06-20)

编辑 慕 萌