生长激素抑制素基因过表达慢病毒载体的构建及鉴定

赵 倩 夏凤艳 刘聪慧

华北理工大学研究生院,①附属医院 河北唐山 063000

生长激素抑制素基因过表达慢病毒载体的构建及鉴定

赵 倩 夏凤艳①刘聪慧①

华北理工大学研究生院,①附属医院 河北唐山 063000

①目的 探讨构建人生长激素抑制素(Somatostatin，SST)基因过表达慢病毒载体的技术方法，为后续构建SST过表达子宫内膜癌细胞系提供基础。②方法 通过设计SST基因引物，使用聚合酶链反应(PCR)的方法，扩增SST基因片段；使用EcoR I和BamHI两种限制性内切酶进行双酶切pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro慢病毒载体和目的基因SST片段，将两者酶切后的片段使用T4 DNA连接酶进行连接，从而使将SST基因插入pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro慢病毒载体上，构建pLVX-SST-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro重组载体；运用双酶切后PCR方法鉴定阳性克隆的pLVX-SST-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro载体；将重组载体转染293T细胞(人胚肾细胞)，进行慢病毒包装并且观察其感染效率及测定病毒滴度。③结果 通过PCR成功扩增SST基因并连接到pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro慢病毒载体上，通过DNA测序鉴定，并与GenBank上的SST基因标准序列进行对比，证明pLVX-SST -mCMV-ZsGreen-PGK-Puro过表达慢病毒载体构建成功，将其转染293T细胞后可观察到绿色荧光的表达。成功包装SST过表达慢病毒载体然后测其滴度为1.0×108TU/mL。④结论 成功构建pLVX-SST -mCMV-ZsGreen-PGK-Puro慢病毒载体，为SST基因的后续研究提供了实验基础。

生长激素抑制素 慢病毒 过表达 载体构建

生长激素抑制素(somatostatin，SST，简称生长抑素)基因定位于人染色体3q27.3，是一种蛋白编码基因，与其相关的通路包括Signaling by GPCR和Peptide ligand-binding receptors。SST基因转录单位含165bp和361bp的两个外显子。SST基因编码的单一前体蛋白交替裂解使SST产生两种活性形式：14aa和28aa。SST有许多作用，近来其对肿瘤的抑制作用逐渐受到重视。SST基因在人体内各个器官组织表达情况不同，可由多种因素调控。SST基因在子宫内膜癌中的表达情况尚不清楚，本研究利用基因工程技术构建过表达SST基因的慢病毒载体，探讨SST基因在子宫内膜癌细胞中高表达是否能够对肿瘤细胞有抑制作用。为进一步研究过表达SST基因在子宫内膜癌中的生物学行为影响提供基础。

1 材料与方法

1.1材料 pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro、293T细胞株、JM109感受态细胞由北京利科生物提供，小量质粒抽提试剂盒及Trans2K Plus II DNA Marker购自北京全式金，琼脂糖购自Omega公司，DNA引物合成及DNA测序由生工生物公司完成，限制性核酸内切酶BamHI、EcoRI和T4 DNA Ligase均购自NEB公司，Qiagen大规模质粒抽提试剂盒购自德国Qiagen公司，HET高效转染试剂盒购自深圳百恩维生物科技，DMEM培养基、胎牛血清FBS、胰蛋白酶Trypsin 0.25%EDTA购自美国invitrogen公司，0.22um针头滤器、Millex-HV 0.45um PVDF filters购自Millipore公司。

1.2方法

1.2.1引物设计 从GenBank资料库中获得人SST的mRNA序列(6750)，设计基因引物。pLVX-SST-EcoRI-F：5'- CGGAATTCATGCTGTCCTGCCGCCTCCAGTG -3'；pLVX-SST-BamHI-R：5'- CGGGATCCCTAACAGGATGTGAAAGTCTTCCAG-3'。

1.2.2PCR反应扩增SST基因片段 反应体系包括：SST正向引物(10μmol/L)2μL，反向引物(10μmol/L)2μL，5×Fastpfu buffer 10μL，ddH2O 30μL，dNTP Mix(2.5mmol/L) 4μL， 模板DNA(100ng/μL)1μL和Fast pfu polymerase 1μL。将以上反应物轻轻混匀，避免产生气泡。然后进入扩增程序，即95℃ 3分钟，然后反复95℃ 20秒，55℃ 30秒，72℃ 2分钟 循环30次，72℃ 5分钟后取出冷却至室温后放入4℃冰箱保存，琼脂糖凝胶回收目的条带，大小351bp，获得SST基因片段。

1.2.3双酶切pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro载体及目的基因 取纯化的pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro质粒/SST 1μg，EcoR I酶1μl，BamHI酶1μL，10×buffer 2μL，10×BSA 2μL，dd H2O 加至20μL， 将上述液体缓慢混合后置于37℃，2 小时，获得酶切后的pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro载体及SST，分别回收质粒pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro酶切大片段和SST双酶切产物。

1.2.4扩增的SST基因片段与pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro载体连接 回收的pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro载体2μL，回收的SST基因 6μL，10×DNA Ligase Buffer 1μL，T4DNA Ligase 1μL，缓慢混匀，22℃，2小时。

1.2.5连接产物转化 取上述连接产物10μL与JM109感受态细胞100μL轻轻混匀，置于冰浴中30 分钟；然后置于42℃水浴中45秒，马上置于冰上放置2 分钟，加入400μL室温下的LB培养基；37℃摇床中培养1小时后4000r/min，离心1分钟，离心后移液枪吸去400μL培养上清；再用移液枪将剩下的100μL轻轻混匀后均匀的涂在含氨苄西林(Ampicillin, 100μg/mL)抗性的含LB的固态培养基的培养板上；倒置放置于37℃恒温培养箱中过夜。

1.2.6阳性克隆鉴定 挑取4个单菌落接种于含5 mL含氨苄西林(100μg/mL)抗性的LB培养液中，37℃摇床，250r/ min，培养过夜；小量质粒抽提试剂盒抽提质粒；使用EcoRI+ BamHI双酶切质粒进行鉴定，阳性克隆可切出351bp的目的基因条带；将鉴定正确的重组克隆质粒进行测序验证。测序引物为：CMV-F(CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG)。将鉴定正确的重组质粒进行慢病毒包装。

1.2.7慢病毒包装 在37℃、5% CO2条件下的培养箱培养人胚肾293T细胞，密度为接种时为10cm细胞培养皿中有6～8×106个细胞，待细胞密度生长到80%～90%时用于转染。在转染前2小时，培养液换为5mL不含双抗的DMEM+10% FBS新鲜完全培养基。DNA混合液，包括目的基因质粒10μg，HET Buffer B 50μL，Lentiviral packaging Vector 15μg和ddH2O425μL。将DNA混合液500μL与HET Buffer A 500μL 完全充分混匀10分钟，室温下静置30分钟，将混合物逐滴均匀加入到细胞培养皿中，慢慢混匀。将培养皿置于37℃、5% CO2培养箱中。12～16小时后弃去培养基，用10mL新鲜的加入双抗的完全培养基换液。培养24小时后，收集上清液，放入4℃冰箱保存，再加入10mL新鲜的含有双抗的完全培养基，放入培养箱继续培养。24小时后按前面方法再一次收集上清，将这次收集的与第一次收集的上清液混合，1000r/min离心5分钟，弃去细胞碎片，上清液以 0.45μm PVDF过滤至离心管中。20000r/min 高速离心2小时，小心弃去上清，并晾干，然后PBS重悬病毒沉淀，按200μL/10cm培养皿的量，之后室温静置2小时，然后用移液器轻轻地吹匀(尽量避免产生气泡)，继续室温放置30分钟，接下来分装到洁净的1.5mL EP管中，-80℃冰箱保存。

1.2.8慢病毒滴度检测 在48孔板中加入3×104cell/孔人胚肾 293T细胞。使用DMEM完全培养基将病毒原液进行10倍梯度稀释。吸取10μL病毒混合液加入到与之对应的48孔板中。 经72小时感染，荧光显微镜下计数48孔板内细胞的荧光情况。一般情况下在最高稀梯度m的孔数出N个带荧光的细胞，则病毒滴度为N×10mTU/μL(m为稀释倍数)，即病毒滴度为N×10m+3TU/ml，一直稀释到N<10。

2 结果

2.1鉴定阳性克隆 经SST基因插入pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro后，进行PCR鉴定，阳性克隆可切出351bp的条带，结果表明，4号为阳性克隆，见图1。

图1 SST重组载体的PCR鉴定

2.2阳性克隆GenBank中测序结果 将构建的重组载体阳性克隆送生工生物公司进行DNA测序分析。测序结果与GenBank上的SST标准基因序列进行对比显示：Identities=351/351(100%)，Gaps=0/351(0%)，结果说明显示含有与设计相同的靶序列，表明已正确构建重组质粒，见表1。

表1 重组质粒DNA测序结果与GenBank上的SST基因标准序列对比结果

2.3pLVX-SST-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro转染人胚肾293T细胞结果 重组慢病毒pLVX-SST-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro转染48小时后，荧光显微镜下可观察到细胞内有明显的绿色荧光，与转染空载慢病毒(转染pLVX -mCMV-ZsGreen-PGK-Puro)相比(图2)，其转染效率相当，表明慢病毒成功转染人胚肾 293T细胞。

图2 荧光显微镜观察重组慢病毒和空载慢病毒转染人胚肾293T 细胞的转染效率

A和B分别为重组慢病毒转染人胚肾293T细胞 48小时后，同一视野下荧光和白光观察所见；C和D分别为空载慢病毒转染人胚肾293T细胞 48小时后，同一视野下荧光和白光观察所见。

2.4慢病毒滴度检测 病毒液滴定量分别为1、0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001μL时的荧光显微镜下重组慢病毒及空载慢病毒的绿色荧光表达情况如图3。结果表明，重组慢病毒滴度1.0×108TU/mL，空载慢病毒滴度1.0×108TU/mL。

A、B、C、D、E、F图为SST过表达慢病毒在荧光显微镜下，a、b、c、d、e、f图为空载慢病毒在荧光显微镜下；Aa为1μL，Bb为0.1μL，Cc为0.01μL，Dd为0.001μL，Ee为0.0001μL，Ff为0.00001μL。

图3 荧光显微镜观察重组慢病毒和毒空载慢病毒转染人胚肾293T 细胞

3 讨论

目前常用的构建稳定转染细胞系的载体包括非病毒载体和病毒载体，其中病毒载体具有转导效率高的优点，得到广泛应用，常用的病毒载体有腺病毒载体、逆转录病毒载体和慢病毒载体等。每种病毒载体均有其各自的优缺点:腺病毒载体的基因组不能整合到宿主的染色体上，只能进行瞬时感染；逆转录病毒载体只能感染处于有丝分裂期的细胞，并且其容量有限。所以本研究为构建稳定转染病毒载体，使用慢病毒作为载体。慢病毒是以人类免疫缺陷型病毒为基础发展起来的基因治疗载体，它不受细胞分裂影响，可感染分裂期以及非分裂期细胞。慢病毒载体通过自身RNA为模板合成双链DNA，并可将目的基因整合到宿主染色体上，其优点为可以在体内较长期地表达且安全性高，并且能够有效转染多种细胞类型[1]。利用慢病毒载体构建稳定转染细胞系，在基础实验研究中具有较广阔的应用前景。

SST具有抑制肿瘤细胞增殖的作用，但因其作用时间短、选择性弱，故为了更好地用于疾病治疗，人工合成了多种SST类似物。SST类似物在肿瘤的临床及实验研究中得到初步应用，如肝癌、结肠癌、乳腺癌、肺小细胞癌、胰腺癌、前列腺癌及消化道肿瘤等[2～8]。但其对各种肿瘤的抑制作用各不相同，且存在个体差异。理论上，通过以上对于SST作用的理解，我们认为在肿瘤细胞中SST应呈低表达，但事实并非如此，在大多数良性及恶性卵巢癌中SST却呈高表达[9]。在子宫内膜异位症中，Marta Annunziata等[10]发现，相较于正常子宫内膜细胞系T HESCs，在异位子宫内膜组织及异位子宫内膜细胞系ESCs中SST的mRNA呈高表达；在子宫内膜癌中，Chen等[11]发现，相较于恶性程度低的子宫内膜癌，在恶性程度高的子宫内膜癌中SST呈高表达。本研究通过构建SST过表达慢病毒载体，为以后SST对肿瘤细胞生物学行为的探究奠定基础。实验选择慢病毒载体pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro，含有BamHI和EcoRI酶切位点，同时将SST的双酶切位点设计为BamHI和EcoRI，将慢病毒载体和目的基因SST经限制性内切酶双酶切后，将SST定向克隆入慢病毒载体的两个酶切位点之间。采用双酶切鉴定的方式鉴定载体是否构建成功，并测序重组的载体，然后进行慢病毒包装并滴度检测，从而成功构建了SST过表达慢病毒载体。

本实验成功构建SST过表达慢病毒载体，为研究SST基因过表达对肿瘤细胞的生物学行为的影响提供基础。

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(2017-03-22收稿)(张爱国 编辑)

Constructionandidentificationoflentiviralvectorofsomatostatingeneover-expression

ZHAO Qian,XIA Fengyan,LIU Conghui

(North China University of Science and Technology,Tangshan 063000,China)

ObjectiveTo construct a lentiviral vector over-expressing somatostatin (SST) gene,and to provide a basis for the subsequent construction of SST over-expressing endometrial carcinoma cell line.MethodsThe primers of SST gene were designed for amplification of SST gene fragments by polymerase chain reaction (PCR).The pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro lentiviral vector and the SST fragment of the target gene were digested with both EcoR I and BamHI restriction enzymes.The fragments cleaved by those were ligated using T4 DNA ligase,so that SST gene was inserted into pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro lentiviral vector to construct pLVX-SST-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro recombinant vector.The candidate clones were identified by PCR after double digestion.The recombinant plasmid was transfected into 293T cells (human embryonic kidney cells), and was packaged.The transfection efficiency was assessed under the fluorescent microscope and the virus titer was determined.ResultsSST gene was amplified and successfully bound to the pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro lentivirus vector. The sequences of the recombinant plasmid were confirmed successfully by DNA sequencing, and compared with the standard sequence of SST gene on GenBank. The expression of GFP could be observed using fluorescent microscope after recombinant lentiviruses were transfected into 293T cells. The recombinant plasmid was packaged and its titer was 1.0×108TU/mL.ConclusionThe pLVX-SST-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro lentiviral vector is successfully constructed, which provide the experimental basis for the next study of SST gene.

Somatostatin.lentivirus.Over-expression.Vector construction

R 722

A

2095-2694(2017)05-356-05

赵 倩(1990-)，女，硕士研究生。研究方向：妇科肿瘤。

夏凤艳。