RAS突变和微卫星不稳定与Ⅲ期结直肠癌患者临床病理特征及预后的相关性分析*

刘建化， 黄成智， 曾卫强， 黎 莹， 杨冬阳， 马 冬△

(广东省人民医院, 广东省医学科学院 1胃肠肿瘤内科， 2胃肠外科， 3药学部， 广东 广州 510180)

RAS突变和微卫星不稳定与Ⅲ期结直肠癌患者临床病理特征及预后的相关性分析*

刘建化1， 黄成智2， 曾卫强3， 黎 莹1， 杨冬阳1， 马 冬1△

(广东省人民医院, 广东省医学科学院1胃肠肿瘤内科，2胃肠外科，3药学部， 广东 广州 510180)

目的检测Ⅲ期结直肠癌患者中RAS和BRAF基因突变以及微卫星不稳定(microsatellite instability，MSI)状态，并分析其临床病理关系及预后。方法收集2010～2015年广东省人民医院共281例经病理学证实的Ⅲ期结直肠癌组织标本，采用PCR-Sanger测序法和免疫组织化学法对石蜡切片进行分析，检测RAS/BRAF基因突变和MSI状态，并探讨其与结直肠癌临床病理特征和预后的关系。结果281例患者中，RAS/BRAF突变率为48.4%(136/281)，其中KRAS突变率最高(116/281，41.3%)。RAS/BRAF基因突变与癌胚抗原水平密切相关(P<0.05)。免疫组织化学法检测到高度MSI(MSI-H)患者18例(6.4%)，MSI-H状态在淋巴结转移N2b期患者中更为常见(P<0.05)。BRAF基因在MSI-H肿瘤中的突变率较高(P<0.01)。RAS/BRAF野生型或者MSI-H患者的总生存期和无进展生存期均明显高于突变型或低度MSI/微卫星稳定患者。结论RAS/BRAF突变和MSI检测有助于结直肠癌生物学行为分析和患者预后判断。

结直肠癌；RAS基因；BRAF基因； 微卫星不稳定

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是全世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率分别位居第3位和第5位[1]，严重威胁人类健康。在我国，CRC发病例数逐年上升。除了手术切除，化疗是最常用的治疗手段，但由于个体基因表型差异，CRC对化疗药物耐药的发生率较高。近年来随着对肿瘤发病机制和生物学行为深入研究，特异性高且不良反应轻的分子靶向药物日益成为研究焦点，为CRC进入精准医学指导下的个体化治疗提供了新思路。

研究证实，CRC发生、发展涉及多基因、多步骤、多途径，其中微卫星不稳定(microsatellite instability，MSI)途径和染色体不稳定途径最为重要[2]。MSI是由错配修复基因突变或启动子甲基化造成的细胞DNA复制错误，在肿瘤基因调控中发挥重要作用[3]，参与多种人类肿瘤发生过程。CRC是MSI发生率较高的恶性肿瘤，90%的遗传性非息肉病性CRC和约10%散发性CRC存在高度MSI(MSI-H)现象[4]。特别值得注意的是，染色体不稳定途径涉及表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor，EGFR)介导的信号传导通路，其与配体结合后可活化下游RAS/RAF/MAPK和PI3K/AKT/mTOR通路从而启动信号转导，诱导肿瘤细胞增殖、分化和侵袭[5]。目前针对EGFR的靶向药物(如西妥昔单抗、帕尼单抗等)已经被广泛用于晚期CRC治疗，其较高的有效率更是开创了靶向治疗里程碑。然而突变型RAS(包括KRAS、NRAS和HRAS)基因可导致 EGFR 信号通路异常激活，不受上游蛋白调控[6-7]，患者不能从抗EGFR治疗中获益。有研究显示，BRAF突变的CRC患者肿瘤进展更快，对抗EGFR药物敏感性更低，生存期更短[8]。故RAS/BRAF基因状态检测对指导临床治疗具有重大意义。

迄今为止，已有针对EGFR信号通路上的RAS/BRAF基因突变和MSI状态与CRC发展转移相关性研究探索[3, 8-9]，但对其临床意义的认识尚不充分，且多为小样本，缺乏系统性报道。本研究基于Sanger测序和免疫组化方法，以确诊为Ⅲ期CRC患者的石蜡包埋组织为研究对象，检测肿瘤中RAS/BRAF基因突变状况和MSI状态，并评价其临床病理特征及预后价值，为CRC风险评估和治疗提供理论依据。

材 料 和 方 法

1病例和材料

回顾性分析2010年1月～2015年10月广东省人民医院共281例经病理学证实的Ⅲ期CRC病例，所有病理标本均经10%甲醛固定，石蜡包埋。每个病例均有明确的起始时间(手术时期)、终点时间及终点状态(生存/死亡)，死亡患者有明确的死亡时间和死因记录。其中男性153例(54.4%)，女性128例(45.6%)，年龄22～84岁，平均59.0岁。存活组121例(43.0%)，中位生存期45.6月；死亡组146例(52.0%)，中位生存期24.2月；14例(5.0%)患者失访。研究对象纳入标准包括：(1)入组前患者均接受手术治疗，病理学诊断为Ⅲ期CRC；(2)病理学标本充足，临床资料齐备；(3)每个患者已签知情同意书。合并炎症性肠病或者机体其它部位原发性肿瘤的患者被排除。总生存期(overall survival，OS)和无进展生存期(progression-free survival，PFS)分别定义为随机化开始至死亡/随访结束以及至局部复发/远处转移/随访结束。肿瘤的临床分期和病理分级依据2010年国际抗癌联盟(The Union for International Cancer Control，UICC)所定的结直肠癌分期法。

2实验方法

2.1标本处理和基因突变检测 采用DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen)提取石蜡包埋肿瘤组织的DNA，用NanoDrop 2000分光光度仪检测提取DNA浓度和A260/A280比值。采用PCR方法进行基因扩增，利用Ion AmpliSeqTMDesigner 1.2.6 软件包(Life Technologies)设计基因引物序列，见表1。扩增条件为：95 ℃预变性5 min； 95 ℃变性30 s， 56 ℃退火45 s， 72 ℃延伸20 s，共45个循环；最后72 ℃延伸5 min。PCR产物纯化后，用ABI 3730XL测序仪(Invitrogen Life Technologies)对KRAS(外显子2、3、4)、NRAS(外显子2、3、4)、HRAS(外显子2)和BRAF(外显子15)基因进行Sanger测序，测序结果采用 Chromas和DNAMAN软件读取，并与NCBI基因库序列对比分析。

2.2免疫组化实验 每个蜡块取4 μm厚连续切片，免疫组化方法检测CRC中错配修复蛋白MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的表达。SP免疫组化试剂盒购自北京中杉公司，鼠抗人单克隆抗体购自Cell Signaling Technology。检测时切片常规脱蜡，抗原修复，分别滴加鼠抗人MLH1(1∶150)、MSH2(1∶100)、MSH6(1∶150)及PMS2(1∶150)，4 ℃孵育过夜，次日加入 II 抗，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片。实验中以正常细胞染色作为对照，肿瘤细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性表达。MSI结果判定：4个蛋白均呈阳性表达即为微卫星稳定(mircosatellite stability，MSS)；出现1个阴性表达为低度MSI(MSI-L)；出现2个或2个以上阴性表达为MSI-H。

表1 RAS和BRAF基因扩增的引物序列和片段长度

3统计学处理

结 果

1RAS/BRAF基因突变频率及类型

在281例Ⅲ期CRC组织标本中，RAS/BRAF突变率为48.4%(136/281)，其中KRAS突变率最高(116/281，41.3%)。在KRAS突变的患者中，第2、3、4外显子突变例数分别为99例(85.3%)、4例(3.5%)和13例(11.2%)，其中第2外显子第12密码子的p.G12D突变最常见(41/116，35.3%)。图1为检测到的代表性突变型KRAS测序图谱。与KRAS基因相比，NRAS(包括第2、3、4外显子)和BRAF(包括第15外显子)突变率较低：NRAS基因突变患者6例(2.1%)，以p.G12D突变最常见(3/6，50%)，未检测到第4外显子突变；BRAF基因突变患者19例，均为p.V600E突变，见表2。本研究未检测到HRAS突变。

Figure 1. The representative sequencing chromatograph demonstratingKRASmutations in exon 2 (A) and exon 4 (B).

图1结直肠癌患者突变型KRAS基因测序图谱

在突变患者中，2例患者同时携带KRAS(p.G12D)和BRAF(p.V600E)突变，3例患者同时携带KRAS(p.G12D/p.A146T)和NRAS(p.G12D/p.A18T/ p.Q61L)突变，而本研究未检测到BRAF和NRAS基因突变共存。

2免疫组织化学法检测Ⅲ期CRC患者中MSI状态

免疫组织化学染色证实：MSI-H患者18例(6.4%)，MSI-L患者38例(13.5%)，MSS患者225例(80.1%)，其中MSI-H/KRAS(p.G12D/p.G13D)7例，MSI-H/BRAF患者4例，而在MSI-H和MSI-L患者中，MLH1表达缺失最为常见(31/56，55.4%)。图2为1例代表性的MSS病例。

表2KRAS、NRAS和BRAF基因各个外显子不同突变亚型的发生率

Table 2. Mutation subtype frequency distribution ofKRAS,NRASandBRAFgenes

Genemutationsn(%)KRAS p．G12D41(35．3) p．G12V25(21．6) p．G12C10(8．6) p．G12A6(5．2) p．G12R3(2．6) p．G12S1(0．9) p．G13D13(11．2) p．A59T3(2．6) p．Q61H1(0．9) p．A146T7(6．0) p．A146V2(1．7) Others4(3．4)NRAS p．G12D3(50．0) p．A18T1(16．7) p．Q61L1(16．7) p．Q61R1(16．7)BRAF p．V600E19(100)

3RAS/BRAF基因突变和MSI状态与Ⅲ期CRC临床病理特征的相关性

本研究探讨了RAS/BRAF基因突变和MSI状态与Ⅲ期CRC患者的临床病理联系，卡方检验分析可见KRAS基因在癌胚抗原(carcino-embryonic antigen，CEA)≥20 μg/L患者中突变率高于CEA<20 μg/L患者(P<0.05)；NRAS基因在c-MET阴性/弱阳性表达患者中突变率为12.5%，明显高于c-MET中/强阳性患者(P<0.01)；而BRAF基因突变与肿瘤部位密切相关，右半结肠癌明显高于左半结肠癌及直肠癌患者(P<0.01)。但是RAS/BRAF基因突变与肿瘤分化程度、浸润深度及区域淋巴结转移无关，见表3。

MSI状态与Ⅲ期CRC区域淋巴结转移显著相关，在N1、N2a和N2b患者中MSI-H所占比例分别为7.3%、0.0%和13.3%，即≥7个区域淋巴结转移的患者更多呈MSI-H状态(P<0.05)，而与患者的肿瘤部位、分化程度、浸润深度、c-MET表达和CEA水平无关，见表4。

Figure 2. Immunohistochemical staining pattern of a microsatellite stability (MSS) in colorectal carcinoma (original magnification, ×100; magnification at the top right corner, ×400). A: negative control; B: MLH1 positive expression; C: MSH2 positive expression; D: MSH6 positive expression; E: PMS2 positive expression.

图2免疫组化检测的MSS结直肠癌患者

此外，本研究检测发现BRAF基因在MSI-H肿瘤中的突变率(22.2%，4/18)高于MSI-L/MSS肿瘤(5.7%，15/263)(P<0.01)，而KRAS和NRAS基因突变与MSI状态无关，见表5。

表3 RAS/BRAF基因突变与281例Ⅲ期结直肠癌患者的临床病理关系

CEA: carcino-embryonic antigen.

4生存分析

截止到2016年12月1日随访结束，56.9%(160/281)的Ⅲ期CRC患者死亡，均死于肿瘤复发或转移，中位随访时间36.0月(0.2～73月)，21例(7.5%)患者失访。本研究进一步评估了RAS/BRAF基因突变和MSI状态对Ⅲ期CRC患者预后生存的影响。结果显示RAS/BRAF野生型患者OS和PFS均明显高于突变患者(2=17.787，P<0.01和2=15.662，P<0.01)；同样，MSI-H患者的预后优于MSI-L/MSS患者(OS：2=5.963，P<0.05； PFS：2=3.971，P<0.05)，见图3。

讨 论

CRC是临床病理异质性较高的恶性肿瘤，其起病隐匿，侵袭性高。近年来EGFR作为CRC治疗的一个重要靶点已经引起广泛关注[5]，特别是EGFR信号通路中起关键作用的RAS/BRAF基因异常更与人类肿瘤恶性转化密切相关。同时，作为CRC另一发病机制，MSI检测成为CRC高危人群筛选和治疗选择的一种新手段，美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)已批准程序性细胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1，PD-1)抑制剂用于治疗具有MSI-H的晚期实体瘤患者，这是FDA首次批准不按肿瘤来源，而直接按照生物标志物使用的抗癌药物，是肿瘤治疗史上一个重大突破[4]。目前，靶向药物联合免疫治疗已成为CRC研究热点。我们希望在此基础上，进一步探讨RAS/BRAF突变和MSI的相关性及其与CRC发生发展关系，从而找出新的分子诊断、治疗和预后判定方法，在基因水平实现CRC个体化治疗，使病人生存获益。

本研究对281例Ⅲ期CRC组织标本进行检测，结果显示RAS/BRAF突变率为48.4%(136/281)，6.4%(18/281)患者为MSI-H；其中KRAS基因第2外显子突变率最高，而RAS家族其它成员比如NRAS和HRAS的突变则较为罕见。值得一提的是，不同于RAS基因突变的异质性，BRAF突变具有同质性，均为V600E突变。上述结果与国外的研究类似[9-10]。有研究显示[11]，BRAF基因突变率在CRC患者里为4%～10%，同样的结论在我们的研究中也得到证实(6.8%，19/281)。此外，本研究也观察到突变的KRAS、NRAS和BRAF基因之间以及突变基因和MSI-H状态之间并不具有排他性，1.8%(5/281)患者同时存在2种基因突变，KRAS与BRAF突变、KRAS与NRAS突变相互重叠，而NRAS与BRAF突变却是相互独立的；遗憾的是我们未检测到同一基因不同外显子的突变共存，这些结果与近年来报道[12]部分不符，可能原因是所选样本来源不同(中国人对比欧美人)以及样本量存在差异。最近，一项回顾性研究也提出，MSI-H与RAS/BRAF突变之间并不排斥[13]，同样我们的实验检测到11例MSI-H患者同时具有KRAS或BRAF突变。RAS/BRAF基因突变在CRC肿瘤发生早期即出现，肿瘤进程中癌细胞的MSI状态始终不变。令人鼓舞的是，随着基因谱数据不断积累，基因之间的相关性将被进一步阐明。

表4MSI状态与281例Ⅲ期结直肠癌患者的临床病理关系

Table 4. The correlation between the microsatellite instability (MSI) status and clinicopathological features in 281 patients with stage Ⅲ colorectal cancer

ClinicopathologicalfeaturenMSI⁃H(%)MSI⁃L/MSS(%)PTumorlocation Leftcolon1226(4．9)116(95．1)0．646 Rightcolon353(8．6)32(91．4) Rectum1249(7．3)115(92．7)Differentiation Well/moderate16912(7．1)157(92．9)0．559 Poor1126(5．4)106(94．6)Depthofinvasion T110(0．0) 1(100．0)0．622 T2220(0．0)22(100．0) T321015(7．1)195(92．9) T4483(6．2)45(93．8)Nodalstage N119214(7．3)178(92．7)0．035 N2a590(0．0)59(100．0) N2b304(13．3)26(86．7)c⁃METexpression Negative/weak243(12．5)21(87．5)0．358 Moderate514(7．8)47(92．2) Strong20611(5．3)195(94．7)InitialCEA(μg/L) <20424(9．5)38(90．5)0．371 ≥2023914(5．9)225(94．1)

MSI-H: MSI-high； MSI-L: MSI-low； MSS: microsatellite stability.

表5 MSI状态与基因突变的相关性

我们进一步探讨了RAS/BRAF基因突变与Ⅲ期CRC临床病理参数之间的关系，研究表明突变型RAS/BRAF基因在促进CRC发展、侵袭中具有重要临床意义。具体说，KRAS基因在CEA≥20 μg/L的患者中突变率较高，而与其它临床病理学特征无关。国内外有文献报道，KRAS突变多预示患者老龄、肿瘤分化程度低、临床分期晚[11-12]。不同研究结果的差异，可能源于研究人群遗传背景不同。迄今为止，NRAS突变由于检测率低，其临床意义具有一定争议性。在恶性黑色素瘤和白血病里，NRAS突变更多出现在老年患者，一项最近研究表明，右半结肠癌易发生NRAS突变[13]。在本研究中，NRAS突变与c-MET低表达密切相关，提示NRAS突变较其它RAS突变肿瘤恶性度较低。此外，CRC中HRAS突变更为罕见，突变率<0.5%，目前国内尚无有关HRAS突变临床价值的报道。本实验亦未检测到HRAS突变肿瘤。我们的研究同时表明BRAF在女性、右半结肠癌突变率高，这与Martinetti等[11]研究结果基本一致。总之，RAS/BRAF突变的CRC具有更强的侵袭性，最终导致器官浸润、肿瘤扩散。

Figure 3. Kaplan-Meier survival curves of stage Ⅲ colorectal carcinoma samples.

图3Ⅲ期结直肠癌患者的OS和PFS生存曲线

近年来，多个数据显示MSI-H的CRC患者具有明显且独立的临床特征：MSI-H较之MSI-L/MSS患者，多表现为低分化、组织异质性明显、克罗恩样病表现以及淋巴细胞浸润[6, 13]。孟文建等[14]对128例Ⅱ～Ⅲ期直肠癌患者进行分析，得出与上述相同结果，更进一步提出MSI-H好发于右半结肠、女性多见。我们的数据也证实MSI-H患者淋巴结转移更明显。在MSI与RAS/BRAF基因突变相关性研究中，统计显示MSI-H与BRAF突变密切相关，而MSI状态与其它基因突变无关。一项最近的研究也注意到BRAF突变的CRC中MSI-H占40%，结果有统计学意义[6]。然而Ogura等[13]分析表明MSI-L肿瘤更易出现NRAS突变，与其它基因突变无关。这种差异可能原因是入组患者种族不同以及研究方法有异。由此可见，MSI参与CRC发生发展，其状态检测有助于预测CRC生物学行为。

早在上个世纪90年代，KRAS突变作为实体瘤预后不良的因素已被报道，但是直到近些年，RAS/BRAF突变对CRC预后的预测价值才引起广泛关注。同既往研究一样，本实验发现在Ⅲ期CRC中，RAS/BRAF基因突变组，特别是BRAF突变组，其OS和PFS明显低于野生型组；而NRAS突变组的预后较其它突变组好。总之，RAS/BRAF基因突变是CRC预后不良的预测因子。此外，尽管多项国内外研究对MSI状态与各临床分期CRC的预后关系进行了探索，但结论尚未统一。就目前而言，比较一致的是在Ⅱ、Ⅲ期CRC患者中，MSI-H对生存有积极意义[15]，我们的研究结果也支持上述观点。但是MSI状态作为CRC患者生存的预测指标仍需大样本前瞻性临床试验进一步证实。

综上所述，由于本研究的回顾性本质，结果不可避免存在选择性偏倚。研究过程中部分患者临床资料失访，特别是术后未再入院治疗的病人。因此我们需要更多的体内外实验证实上述观点。总之，RAS/BRAF基因突变和MSI-L/MSS状态不仅是Ⅲ期CRC致病机制，也是CRC侵袭力和预后不良的一个新的预测因子，其检测对于判断新发病例预后及制定个体化治疗策略具有重要意义。

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(责任编辑： 卢 萍， 罗 森)

CorrelationofRASmutationsandmicrosatelliteinstabilitywithclinicopathologicalfeaturesandprognosisofpatientswithstageⅢcolorectalcancer

LIU Jian-hua1, HUANG Cheng-zhi2, ZENG Wei-qiang3, LI Ying1, YANG Dong-yang1, MA Dong1

(1DepartmentofGastrointestinalOncology,CancerCenter，2DepartmentofGastrointestinalSurgery，3DepartmentofPharmacy,GuangdongGeneralHospital,GuangdongAcademyofMedicalSciences,Guangzhou510180,China.E-mail:madong8005@126.com)

AIM: To investigate the status ofRAS/BRAFmutations and microsatellite instability (MSI) and their associations with clinicopathological features and prognosis of the patients with stage Ⅲ colorectal cancer (CRC).METHODSThe surgical patients with stage Ⅲ CRC (n=281) were followed up. The mutations ofRAS/BRAFwere examined by PCR amplification-Sanger sequencing, and MSI status was detected using immunohistochemistry (IHC) in their archival paraffin-embedded tissue specimens. The relationships of the status with the clinicopathological features and prognosis of the patients were statistically analyzed.RESULTSAmong 281 patients, the mutations ofRAS/BRAFwere observed in 136 cases (48.4%), including 116 cases (41.3%) ofKRASmutations.RAS/BRAFmutations were highly correlated with the level of carcino-embryonic antigen (P<0.05). Moreover, 18 cases (6.4%) of MSI-high (MSI-H) patients were determined by IHC, and MSI-H status was more common in N2b patients (P<0.05). Correlation study found that the mutation rate ofBRAFwas higher in MSI-H tumors than that in MSI-low (MSI-L)/microsatellite stability (MSS) counterparts (P<0.01), although no association betweenKRAS/NRASmutations and the MSI status was observed. The prognosis in the patients with wild-typeRAS/BRAFor MSI-H was better than the patients with any mutation or MSI-L/MSS (P<0.01).CONCLUSIONMutantRAS/BRAFand MSI may serve as fairly good indicators for prognosis of the patients with stage Ⅲ CRC.

Colorectal cancer;RASgene;BRAFgene; Microsatellite instability

R363； R735.3

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.10.017

1000- 4718(2017)10- 1837- 08

2017- 07- 04

2017- 07- 25

广东省医学科研基金资助项目(No. A2017418)

△通讯作者 Tel： 020-81884713-80521； E-mall: madong8005@126.com

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