基因芯片法在肺结核诊断中的临床应用价值

陈蕾

基因芯片法在肺结核诊断中的临床应用价值

陈蕾

目的探讨基因芯片技术在肺结核诊断中的应用价值。方法采集641例肺结核患者的痰及纤支镜冲洗液标本，同时进行抗酸染色法、MGIT液体培养法+微孔板比例法药物敏感性试验((简称“药敏试验”)及基因芯片法检测，分析不同方法检测结核分枝杆菌(Mtb)及其异烟肼、利福平耐药性的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和kappa值。不同方法之间Mtb及耐异烟肼、耐利福平、耐多药阳性检出率的比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。结果基因芯片法敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和kappa值均较高。基因芯片法Mtb阳性检出率54.91%高于涂片法27.61%，与液体培养法60.06%比较差异无统计学意义。基因芯片法和药敏试验检测Mtb耐异烟肼、耐利福平、耐多药阳性检出率，两者比较差异无统计学意义。结论基因芯片法在检测Mtb及其耐药性方面与传统液体培养法和药敏试验相比，有较高的敏感度和特异度，检测时间短，一致性高，值得临床应用推广。

基因芯片技术；肺；结核分枝杆菌；诊断

资料与方法

一、标本来源

采集2015年11月至2016年11月住院肺结核患者痰及纤支镜冲洗液标本，排除检测失败、污染等因素，实际纳入标本共计641例，其中有痰者取痰液536例，无痰者行纤维支气管镜检查取纤支镜冲洗液105例。对标本同时进行抗酸染色镜检、液体MGIT培养+药敏试验和基因芯片检测。

二、研究方法

1. 涂片检查:采用萋-尼氏染色法，并遵照《痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》[3]的要求进行操作。

2. 液体培养检查:采用BACTEC MGIT960培养基，按照《分枝杆菌分离培养标准化操作程序及质量保证手册》[4]的要求进行培养，所有涂片标本均进行培养检查。

3.药敏试验：经BACTEC MGIT960快速培养后分离的阳性菌株，采用微孔板比例法，按照《结核分枝杆菌药物敏感性试验标准化操作程序及质量保证手册》[5]的要求进行药敏试验。

4.基因芯片法：利用仪器对患者标本经过标本处理-核酸提取-PCR扩增-杂交反应-芯片扫描-自动判读，发现突变的耐药基因。根据Mtb的耐药性与基因突变有关的分子机制，通过检测位点的突变情况判断耐药性，如利福平耐药相关基因ropB、异烟肼耐药相关基因KatG、inhA。如果耐药相关基因为野生型，判断为相应药物敏感，如耐药相关基因为突变型，判断为相应药物耐药。

5.试剂与仪器

试剂：试验所用染色液、药敏试验用培养基均由珠海贝索生物技术有限公司提供。基因芯片法试剂包括晶芯分枝杆菌核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)、晶芯分枝杆菌菌种鉴定试剂盒、晶芯Mtb耐药基因检测试剂盒(DNA微阵列芯片法)、核酸提取液、PCR扩增试剂、杂交缓冲液、配套基因芯片等购自北京博奥生物有限公司

仪器：晶芯ExtractTM核酸快速提取仪、CapitalBio基因芯片杂交盒、BioMixerTM芯片杂交仪、AB1 7500PCR扩增仪、Slide-WasherTM芯片洗干仪、LuxScanTM10K-B微阵列芯片扫描仪等均购自北京博奥生物有限公司。

6.统计学分析：应用SPSS13.0软件进行统计学分析。以液体培养法为金标准，计算涂片法、基因芯片法检测Mtb的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值。以药敏试验为金标准，计算基因芯片法检测异烟肼、利福平耐药性的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值。不同方法检测结果的一致性用kappa检验判别(kappa≥0.75具有高度一致性，0.75>kappa≥0.4具有较好一致性，kappa<0.4具有较差一致性)。不同方法之间Mtb及异烟肼、利福平、耐多药阳性检出率的比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、 采用涂片法、培养法、基因芯片法检测分枝杆菌结果

641例标本(痰536例，纤支镜冲洗液105例)同时采用三种方法检测Mtb，以液体培养法检测结果为金标准，基因芯片法检测技术的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为86.23%(332/385)、92.19%(236/256)、94.32%(332/352)、81.66%(236/289)，kappa检验，K=0.77,两者具有高度的一致性；抗酸染色涂片法检测技术的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为45.71%(176/385)、99.61%(255/256)、99.44%(176/177)、54.96%(255/464)，kappa检验，K=0.40,两者具有较好的一致性(见表1)。

二、 采用药敏试验、基因芯片法检测Mtb异烟肼、利福平耐药性结果

641例标本通过培养共获得385例阳性Mtb菌株。排除耐药检测失败等因素，可比对的332例Mtb(痰257例，纤支镜冲洗液75例)以药敏试验检测异烟肼、利福平耐药结果为金标准，基因芯片法检测异烟肼、利福平耐药的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为75.41%(46/61)、99.63%(270/271)、97.87%(46/47)、94.74%(270/285)和79.17%(38/48)、97.54%(277/284)、84.44%(38/45)、96.52%(277/287)。kappa检验两者分别为K值0.82及0.79,两者具有高度的一致性(见表2)。

三种检测方法Mtb阳性检出率比较：641例标本同时采用抗酸染色法、液体培养法、基因芯片法检测Mtb，总体阳性检出率分别为27.61%(177/641)、60.06%(385/641)、54.91%(352/641)。基因芯片法阳性率高于抗酸染色法，两者比较差异有统计学意义(χ2=98.56，P<0.05)；低于液体培养法，但两者比较差异无统计学意义(χ2=3.47，P>0.05)。抗酸染色法阳性率低于液体培养法，两者比较差异有统计学意义(χ2=137.13，P<0.05)。

表1 涂片法、培养法、基因芯片法检测Mtb结果

表2 药敏试验、基因芯片法检测Mtb异烟肼、利福平耐药性结果

不同标本类型比较Mtb阳性检出率:痰标本基因芯片法低于液体培养法，两者比较差异有统计学意义(χ2=10.19，P<0.05)。纤支镜冲洗液标本基因芯片法高于液体培养法，两者比较差异无统计学意义(χ2=1.75，P<0.05)(见表3)。

表3 三种检测方法Mtb阳性检出率比较

三、 两种检测方法Mtb耐异烟肼、耐利福平、耐多药阳性检出率比较

比对分析药敏法和基因芯片法检测332例Mtb的耐药性，异烟肼耐药率分别为18.37%(61/332)和14.16%(47/332)，两者间差异无统计学意义(χ2=2.17,P>0.05)。利福平耐药率分别为14.46%(48/332)和13.55%(45/332)，两者间差异无统计学意义(χ2=0.11,P>0.05)。耐多药率分别为13.25%(44/332)和11.14%(37/332)，两者间差异无统计学意义(χ2=0.69,P>0.05)(见表4)。

讨 论

基因芯片技术在检测Mtb及耐药性的临床应用越来越广泛，其结合了分子生物学高灵敏度和生物芯片的高通量性具有快速、灵敏、准确等特点[6]。目前国内外多家机构研究报道显示，应用基因芯片技术检测Mtb及其耐药性方面灵敏度、特异度各家不一。本研究利用基因芯片技术检测我院住院病人641例标本的Mtb及耐药性，通过与传统方法相比较，探讨其在肺结核病诊断方面的应用价值。

表4 两种检测方法耐药Mtb阳性检出率比较

一 、Mtb检测

以液体培养法为金标准，与抗酸染色法相比，基因芯片法敏感度(82.23%)显著高于抗酸染色法(45.71%)，特异度(92.19%)与抗酸染色法(99.61%)相似，一致性达0.77，显著高于涂片法(K=0.40)。提示检测Mtb该方法优于抗酸染色法且可靠性佳。本研究中基因芯片法敏感度特异度与董永康等报道的敏感度92.3%特异度100%略有差异[7]。这可能一方面与选择的金标准不同有关，本实验以MGIT液体培养法作为金标准，液体培养法耗时长但自我繁殖能力强检测敏感度相对最高；另一方面与标本质量有关，本研究中的53例基因芯片未检测出的Mtb均为痰标本，提示痰标本的质量、细菌数量可能低于纤支镜冲洗液，降低检测敏感度。20例培养阴性基因芯片阳性的标本分析，液体培养法漏检主要与实验人员的操作(如配制的菌悬液偏低，过早判读菌落生长结果等)和受试菌株的生长状态等因素有关。传统液体培阳法操作繁琐、费时，影响因素多，生物安全防护要求高，在基层实验室不易实施，本研究印证了基因芯片法灵敏度特异度较高且快速可靠，对临床快速诊断有十分重要的意义[8]。

二、耐药性检测

以药敏试验为标准，基因芯片法检出Mtb耐利福平敏感度79.17%、特异度97.54%、K值0.79，耐异烟肼敏感度75.41%、特异度99.63%、K值0.82，敏感度略低于李晓菲等的报道[9]。上述结果的差异一方面可能与后者所研究的涂阳标本增加耐药表型敏感度有关。另一方面本研究中异烟肼15例、利福平10例耐药表型阳性与基因型不一致,分析可能与分枝杆菌菌种差异、混合感染等因素有关，此类耐药表型与基因型不一致现象国外亦有报道，在临床仅为少数，不影响该技术临床应用价值[10]。值得注意的是本研究中利福平7例耐药基因型阳性与表型不一致，分析可能与低浓度耐药突变导致耐药表型无法检测出有关[11]。总体来说基因芯片的敏感度特异度均较高，尤其耐异烟肼和耐利福平检测特异度极佳，且均具有极好的一致性(K值均大于0.75)，提示该方法能够快速准确检测Mtb对异烟肼和利福平的耐药性，在结核病的快速诊疗领域具有广阔的应用前景。

三、 Mtb 及耐药性阳性检出率

本实验同时采用抗酸染色、液体培养及基因芯片法检测Mtb，液体培养法检测阳性率(60.06%)最高，其次为基因检测法(54.91%)，抗酸染色法(27.61%)最低。基因芯片法检测Mtb阳性率高于抗酸染色法，两者比较差异有统计学意义；低于液体培养法，但两者比较差异无统计学意义。提示在检测Mtb方法准确性上基因芯片法优于传统涂片法，在快速性上优于液体培养法。比对分析药敏法和基因芯片法检测Mtb的耐异烟肼、耐利福平、耐多药阳性检出率，两者间差异均无统计学意义。提示相对于传统抗酸染色、培养技术而言，基因芯片法不但提高了Mtb检测的敏感度和稳定性，而且在耐药性检测效能上接近药敏法且快速性上更具优势。

四、不同标本类型Mtb及耐药性阳性检出率

不同标本类型间Mtb阳性检出率比较，仅基因芯片法阳性率痰标本50%与纤支镜冲洗液标本70.48%比较差异有统计学意义(χ2=14.79，P<0.05)，其余涂片法27.43%与28.57%比较(χ2=0.06，P>0.05)、液体培养法59.70%与61.90%比较(χ2=0.0.18，P>0.05)差异均无统计学意义。不同标本类型间耐药Mtb阳性检出率比较，无论基因芯片法还是药敏法检测均高度一致。提示一方面支气管冲洗液可根据纤支镜镜下所见直接取材病变部位，避免口咽部细菌污染，同时冲洗作用疏通引流支气管并引出远端病灶的Mtb，回收细菌多，故基因芯片Mtb阳性检出率更高，另一方面纤支镜冲洗液标本量相对较少，需在今后工作中加大样本量进一步分析评估。

总之，基因芯片法检测痰液及纤支镜冲洗液中Mtb具有较高的敏感性和特异性，一致性好，操作简单，自动化程度高，生物危害度小，虽然检测Mtb方面与选用参考标准、标本类型存在一定差异，分析耐药范围较狭窄，技术成本昂贵，但其6小时就可检测异烟肼、利福平耐药性的特点，相对于需要漫长等待的培养和药敏试验结果来说，对于临床快速准确诊断和治疗结核病具有更加重要的意义，值得临床推广应用。

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Genechipindiagnosisofpulmonarytuberculosisanditsclinicalapplicationvalue

CHENLei

PublicHealthyClinicalMedicalCenterofChengdu,Chengdu,Sichuan610000,China

ObjectiveTo explore the application value of gene chip technology in diagnosis of pulmonary tuberculosis.MethodsThe data of 641 cases of pulmonary tuberculosis patients with sputum and bronchoscopic lavage specimens were detected by acid fast stain, MGIT liquid ((hereinafter referred to as "drug sensitive test") detection and gene chip method. Their drug sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value and Kappa value of Mycobacterium tuberculosis (Mtb), isoniazid and rifampicin were analyzed, and the results were analyzed by X2 test among different groups.P<0.05 difference was statistically significant.ResultsThe sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value and Kappa value were higher for gene chip method. The positive rate of Mtb was 54.91% in the gene chip group, which was higher than 27.61% of the smear method group (P<0.05) and similar with 60.06% of the liquid culture method group. There was no significant difference in the positive rate of isoniazid, rifampin and multi-drug resistance of Mtb between the gene chip group and the drug sensitive test group.ConclusionGene chip method has high sensitivity and specificity and consistency in detection of Mtb and its drug resistance, which is worthy of widely clinical application.

gene chip technique; pulmonary; Mycobacterium tuberculosis; diagnosis

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.010.038

610000 四川 成都，成都市公共卫生临床医疗中心(净居寺院区)

结核病的病原学诊断，目前临床上还是主要依赖于传统的涂片法和培养法。涂片法敏感度较低，特异度较差；作为金标准的液体培养法加药物敏感性试验(简称“药敏试验”)方法耗时长，需要4-8周才能获得结果，且程序繁琐，重复性差，对结核病尤其是耐药结核病的早期诊断治疗带来了障碍[1]。因此，临床迫切需要一种新型、快速、准确的检测方法，快速完成结核分枝杆菌(Mtb)检测及耐药性分析，为临床治疗争取时间。近年来应用分子生物学诊断技术检测Mtb成为传统诊断方法的重要补充，也是结核病快速诊断主要的研究方向[2]。基因芯片技术是一种新型核酸检测方法，可快速检测结核分枝杆菌耐利福平和异烟肼3个基因(ropB、KatG、inhA)的常见突变位点，并鉴定非结核分枝杆菌属。本研究将基因芯片法与传统痰涂片检查、液体培养法做比较，对该技术检测痰和纤支镜冲洗液标本中结核分枝杆菌的效果和临床价值进行评价。

2017-02-04 ]