利用多重PCR技术同时检测6种棉花转化体的方法研究

李忆，尹全，刘勇

利用多重PCR技术同时检测6种棉花转化体的方法研究

李忆1#，尹全2#，刘勇3*

（1.四川民族学院环境与生命科学系，四川康定626001；2.四川省农业科学院分析测试中心，成都610066；3.四川省农业科学院植物保护研究所，成都610066）

【目的】建立1种转基因棉花多重聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）检测方法。【方法】试验选择6种转基因棉花作为多重PCR检测对象，通过引物终浓度配比和引物退火温度的两要素全组合优化多重 PCR反应体系，并分析方法灵敏度。【结果】多重 PCR较优的 MON1445、GHB614、MON15985、MON88913、LLCOTTON25、MON531 引物终浓度为 0.25、0.30、0.25、0.16、0.30、0.20 μmol·L－1， 较优引物退火温度为56℃，方法灵敏度为66个拷贝棉花基因组。利用盲样对上述体系的验证结果显示，所有盲样扩增条带与其含有的转基因转化体完全一致。【结论】本研究建立的体系可用于6种棉花转化体的快速检测。

棉花；多重PCR；特异性引物；检测

Abstract:[Objective]The aim of this study was to establish a multiplex polymerase chain reaction(PCR)detection method for transgenic cotton.[Method]Six events in genetically modified cotton were selected for multiplex PCR.Specific primers were designed based on national standards or related literature.The ratio of primer concentration,annealing temperature,and sensitivity of the multiplex PCRreaction system were optimized.[Result]The optimal concentrations for primers MON1445,GHB614,MON15985,MON88913,LLCOTTON25 and MON531 were 0.25,0.30,0.25,0.16,0.30,and 0.20 μmol·L－1,respectively;the optimal annealing temperature of the multiplex PCRwas 56℃;the detection sensitivity of the method was 66 copies of the cotton genome.The verification results of the system showed that the amplified bands of all the known samples were identical to those of the transgenic events.[Conclusion]The system established in thisstudy can be used for therapid detection of six events occurring in genetically modified cotton.

Keywords:cotton;multiplex PCR;specific primer;detection

棉花是较早成功实施商业化转基因品种种植的植物之一，目前包括我国在内的许多国家如印度、美国、阿根廷和南非等均大规模种植转基因棉花，且发展非常迅速[1-2]。据国际农业生物技术应用服务组织（The International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications，ISAAA）统计，我国2015年转基因棉花种植面积达370万hm2，面积有所下降，但其采用率从2014年的93%升高到2015年的96%[3]。目前我国商业化种植的转基因棉花均为自主研发的转Bt基因抗虫棉花。除种植外，我国还允许国外抗虫转基因棉花531等9种转基因棉花进口用作加工原料[4]。

随着转基因棉花的广泛种植以及大量进口转基因棉花用作加工原料，出于对转基因作物安全性的考虑，我国于2002年3月20日起施行《农业转基因生物标识管理办法》，要求对5类转基因生物所涉及的17种转基因产品进行标识，其中包括转基因棉花种子及其产品[5]。因此，建立1套方便、快捷的棉花转基因产品检测技术是贯彻标识制度的重要前提。近年来国内外关于转基因植物检测的报道多涉及转基因大豆、玉米、水稻及其加工产品[6-8]；而对于转基因棉花的检测研究报道则相对较少，已有研究报道主要集中在单一聚合酶链式反应 （Polymerase chain reaction，PCR）检测和酶联免疫吸附测定 （Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测[9]，且现有检测技术存在操作复杂、成本花费高、检测耗时长以及无法同时检测多种转化体等缺点。

因此，多重PCR技术在转基因及其产品检测中应运而生。多重PCR是指在常规PCR的基础上，向1个反应体系中加入多对特异性引物，针对1个或多个DNA模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术[10-11]。近年来，多重PCR技术得到了较大的发展。尹全等[12]利用多重PCR方法检测了抗除草剂棉花LLCOTTON25，Germini等[13]建立了1个能同时区分4种转基因玉米和1种转基因大豆的多重PCR体系，陈贞等[14]建立了菜籽粕转基因成分多重PCR检测体系。多重PCR技术在转基因及其产品检测中有重要应用价值。

目前，我国国家或行业标准中转基因棉花转化体的检测方法均为单一PCR检测技术，国内少数学者进行过转基因棉花多重PCR方法研究，但仅局限于多个基因或3～4种转化体的多重PCR检测[1-2]。为了提高转基因棉花多个转化事件特异性检测效率，本研究选择6种进口用作加工原料的转基因棉花转化事件作为研究对象，旨在建立1种能快速准确检测6种转基因棉花转化体的多重PCR方法。

1 材料与方法

1.1 供试材料及试剂

转基因棉花 MON1445、GBH614、MON15985、LLCOTTON25、MON531和 MON88913 来源于美国油脂化学家协会（American Oil Chemists'Society，AOCS）；转基因油菜 GT73来源于美国FLUKA公司；转基因玉米Bt11和Bt176来源于欧盟委员会联合研究中心（Joint Research Centre，JRC）标准物质与测量研究所（Institute for Reference Materials and Measurements，IRMM）；转基因大豆GTS40-3-2来源于美国孟山都公司；转基因油菜RF2、转基因甜菜H7-1、转基因水稻TT51-1为本实验室保存。植物基因组提取试剂盒购于成都博瑞克生物技术有限公司；Master Mix购于日本东洋纺绩株式会社；毛细管电泳预制凝胶卡夹、分子质量标准品（Size marker）购于成都爱奇艺生物技术公司。

1.2 仪器设备

离心机（5424，德国 Eppendorf公司），PCR 仪（Veritee96-well，美国 ABI公司），DNA 超微量分光光度计（NanoDrop 1000，美国 Thermo 公司），毛细管电泳仪（QIAxcel Advanced，德国Qiagen公司）。

1.3 PCR引物序列

试验引物序列（表1）参照国家相关标准或相关文献资料选取，引物由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成，并将所有引物浓度稀释至10 μmol·L－1待用。

1.4 样品总DNA提取与制备

试验样品采用干磨杯粉碎处理，称取粉碎试验样品100 mg用于样品总DNA的提取，提取步骤参照北京天根生化植物基因组提取试剂盒说明书。样品总DNA提取后采用超微量紫外分光光度计测定质量浓度和纯度。然后用1×TAE缓冲液将各样品总DNA稀释至25 mg·L－1待用。

1.5 引物特异性验证

采用标准或文献中推荐的反应体系和反应条件对引物特异性进行PCR扩增，PCR扩增产物采用毛细管电泳进行分析，验证各引物对特异性。

1.6 多重PCR退火温度及引物浓度两要素全组合优化

多重PCR退火温度和引物浓度（表2）按照两要素全组合设计进行优化，反应体系为25μL，其中 Master Mix（2×）12.5μL，引物终浓度配比按照表2设置8个浓度梯度，模板2μL，ddH2O补足25μL。反应条件：第一阶段94℃预变性3 min；第二阶段94℃变性40 s，退火温度梯度为50、54、56、58、60、64 ℃，退火 30 s、72 ℃延伸 30 s，35个循环；第三阶段72℃延伸3 min，最后4℃保存。对PCR扩增产物进行毛细管电泳分析，确定引物终浓度和引物退火温度。

表1 引物序列及扩增产物Table 1 The sequence of primers and the length of amplified productions

1.7 多重PCR灵敏度分析

棉花转化体DNA以TE缓冲液进行梯度稀释，使得每个反应体系中棉花基因组分别为264、132、66、33、16、8、4、2、1 个拷贝 （1 ng DNA 约合440拷贝棉花基因组），检测体系设置清水为空白对照进行质量控制。

1.8 多重PCR盲样分析

利用本研究优化建立的多重PCR检测体系对盲样进行分析，验证该方法是否可靠，检测体系设置空白对照（水）进行质量控制。

表2 多重PCR引物终浓度方案Table 2 The design of primer concentrations in the multiplex PCR μmol·L－1

2 结果与分析

2.1 样品DNA提取制备结果

对提取纯化后的样品总DNA进行测定，所有样品OD260nm/OD230nm均大于2.0，OD260nm/OD280nm均在 1.8～2.0，质量浓度均大于 25 mg·L－1。 以上结果表明，样品总DNA质量较好，满足下一步试验研究需要。

2.2 多重PCR引物特异性验证结果

由转化体扩增图谱（图1）可见，在含有相关转化体的样品中6对引物均能在相应目标位置处观察到特异性条带，并且未见非特异性条带扩增，在不含相关基因的样品中未见特异性条带和非特异性条带扩增；空白对照（水）未见条带扩增，说明检测体系正常。由此可见，本试验选择的引物对可用于多重PCR检测体系研究。

图1 转化体扩增图谱Fig.1 PCR amplification of the events

2.3 多重PCR两要素全组合优化结果

图2 引物浓度配比和退火温度全组合优化扩增图谱Fig.2 The optimized amplification map of primer concentrations and annealing temperature

两要素全组合优化结果表明：退火温度太低、引物浓度太高都容易产生非特异性条带，而退火温度太高、引物浓度太低又不能获得理想的目的条带，只有在相对适宜的退火温度和引物浓度情况下才能得到理想的结果。由图2可见，在较低退火温度50℃条件下，所有引物浓度梯度都会在200 bp上下各出现1条非特异性条带扩增，而且有的引物浓度下还会出现引物二聚体，很显然50℃条件下所有引物浓度均不适宜；而在较高退火温度区58℃、60℃、64℃的条件下，每个引物浓度均会有至少1条目的条带未得到理想扩增，退火温度越高，得到的目的条带越少，所以58℃、60℃、64℃的退火温度条件均不适宜。在退火温度54℃和56℃条件下，引物浓度梯度为A、B、E、G、H方案时均有 1条目的条带的扩增不理想，而引物浓度梯度为C、D、F方案时，各目的条带均被有效扩增。考虑到各目的条带扩增效率的一致性，最终选择D方案作为多重PCR引物浓度配比，选择56℃作为多重PCR退火温度。

2.4 多重PCR灵敏度分析结果

多重PCR灵敏度试验结果显示，在棉花基因组不低于66个拷贝时，6个目标片段均可被有效扩增（图3）。而当棉花基因组为33个拷贝时，虽然几个基因都能被扩增，但MON1445和GHB614的目的条带扩增量太小，条带模糊，不能准确判断目的条带。表明所建立的多重PCR检测体系灵敏度可达66个拷贝棉花基因组。

图3 灵敏度扩增图谱Fig.3 PCR amplification of the sensitivity samples

2.5 多重PCR盲样分析结果

采用此多重PCR体系检测盲样的结果表明，所有盲样扩增条带与其含有的转基因转化体完全一致（图4）。此结果进一步验证了建立的多重PCR检测方法可靠性较好。

3 讨论

Chamberlain等[20]于1988年首次提出的多重PCR方法，已被广泛应用于基因多态性分析、定性定量分析、微生物耐药检测及动物源性检测等领域。它是科研、检测工作的重要手段，具有很高的实用价值，可大大节约试剂、减少操作时间以及降低检测成本[21]。李会等[22]对多重PCR法快速检测转基因玉米多种转化体技术优势进行了比较，研究结果表明与单一PCR检测技术相比，成本降低了75%，检测耗时缩短了63%，检测产生的废液减少了75%。

本研究选择我国进口用作加工原料的转基因棉花 MON1445、GBH614、MON15985、LLCOTTON25、MON531和MON88913等6种转化体作为检测对象建立的多重PCR检测技术体系，通量较高，有效提高了转基因棉花的检测效率，为转基因棉花检测行业提供了1种检测方法。

图4 多重PCR盲样扩增图谱Fig.4 Multiplex PCR amplification of the blind samples

多重PCR的优化过程中主要需要考虑的因素是引物的选择。一方面，如果选择的引物间易产生二聚体，会影响对特异性扩增片段的判断。本试验为避免引物产生二聚体，采用Primer 5.0的Multiplex primer功能，对选用引物进行二聚体检验；另外，本反应体系选用含有高质量重组Taq DNA聚合酶的Master Mix，能提高扩增效率，有效减少引物二聚体和非特异性条带产生。另一方面，如果选择的引物特异性扩增片段大小太接近，也会影响试验对特异性扩增片段的判断。本试验不同引物特异性扩增片段大小差异最小为21 bp，若采用分辨率相对较低的普通琼脂糖凝胶电泳分析结果会存在一定困难。因此，本试验选择分辨率为3～5 bp的毛细管凝胶电泳分析扩增产物以满足试验要求。

多重PCR的优化过程中另一个需要考虑的因素是反应体系中引物的浓度配比和反应程序中的引物退火温度。多重PCR的优化通常根据扩增条带质量调整不同引物的浓度，降低过亮条带的引物浓度，增加条带过暗的引物浓度，直至最佳扩增结果[23]。该优化方法已应用于转基因橡胶树[24]、转基因柑橘[25]以及多种致病菌[26]的多重PCR检测，还可用于其他转基因植物、致病菌等多重PCR检测，具有一定的通用性。本试验条件的优化采用引物浓度配比和退火温度全组合方法，共设计8种引物浓度配比和6个引物退火温度梯度48组反应体系进行全组合优化。在两要素全组合优化时非常谨慎，在考虑优化条件设置的基础上，获得了扩增条带特异、引物二聚体少、各基因引物扩增效率相对一致的多重PCR检测体系；通过多重PCR优化结果最终确定了6种转基因棉花转化体多重PCR检测体系的退火温度和引物浓度。由于特异性引物设计对象为6种转基因棉花转化体，所以本研究结果仅适用于选用的6种转基因棉花转化体，并不适用于其他转基因棉花或者转基因植物。

4 结论

试验建立了转基因棉花6种转化体特异检测方法——多重PCR检测方法，其中检测体系：东洋纺2×Master Mix 12.5μL，引物 MON1445、GHB614、MON15985、MON88913、LLCOTTON25、MON531 终 浓 度 为 0.25、0.30、0.25、0.16、0.30、0.20 μmol·L－1，样品 DNA 模板 4 μL，补充 ddH2O至25μL；扩增程序：第一阶段94℃预变性3 min；第二阶段 94℃变性 40 s、56 ℃退火 30 s、72℃延伸30 s，35个循环；第三阶段72℃延伸3 min，最后4℃保存。该方法可实现在1个反应体系中同时检测转基因棉花6种转化体多个转基因成分，检测效率高。此体系可用于所选的6种棉花转化体的快速检测。

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Development of a Multiplex Polymerase Chain Reaction Method for Simultaneous Detection of Six Events in Genetically Modified Cotton

Li Yi1#,Yin Quan2#,Liu Yong3*
(1.Department of Environmental and Life Sciences,Sichuan Minzu College,Kangding,Sichuan 626001,China;2.Analysisand Testing Center,Sichuan Academy of Agricultural Sciences,Chengdu 610066,China;3.Instituteof Plant Protection,Sichuan A-cademy of Agricultural Sciences,Chengdu 610066,China)

S562.035

A

1002-7807（2017）05-0487-08

10.11963/1002-7807.lyly.20170727

2016-12-29

李忆（1982―），女，硕士，xiangfeng_1981@163.com；#同等贡献。*通信作者：liuyongdr@163.com

四川省财政现代农业技术创新与示范专项资金（2014CXSF-040）；四川民族学院自办一般项目（XYB16002）